本文選題：奶山羊　切入點(diǎn)：脂肪酸代謝　出處：《西北農(nóng)林科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：山羊奶富含短、中鏈脂肪酸以及多種不飽和脂肪酸,具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能。反芻動(dòng)物泌乳期乳腺脂肪酸代謝是影響乳中脂肪酸組成的重要生理過程。硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1,SCD1)是乳腺中脂肪酸去飽和化的關(guān)鍵酶,它可以利用棕櫚酸和硬脂酸催化生成棕櫚油酸和油酸,這些單不飽和脂肪酸是構(gòu)成乳中甘油三酯的重要成分。因此,山羊SCD1基因的功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)理研究對(duì)羊奶成分及品質(zhì)調(diào)控具有重要理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。在奶山羊乳腺組織SCD1基因功能分析的基礎(chǔ)上,本研究通過克隆并分析SCD1啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能,研究該基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理。利用腺病毒介導(dǎo)的過表達(dá)和siRNA介導(dǎo)的干擾技術(shù),分析SCD1基因在乳腺上皮細(xì)胞中的功能;克隆了山羊SCD1基因5'側(cè)翼序列,利用生物信息學(xué)分析SCD1啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能。并通過定點(diǎn)突變、過表達(dá)或干擾轉(zhuǎn)錄因子分別研究了轉(zhuǎn)錄因子SREBP1,LXRα,PPARG和外源因子亞油酸對(duì)山羊SCD1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理。本研究的主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建SCD1基因腺病毒過表達(dá)載體,包裝出高滴度的SCD1過表達(dá)腺病毒(Ad-SCD1)。將腺病毒感染山羊乳腺上皮細(xì)胞,與對(duì)照組相比,過表達(dá)SCD1顯著上調(diào)細(xì)胞中甘油三酯含量,以及FASN,DGAT2,GPAM,FABP3和PPARΑ基因的mRNA水平(P0.05),并顯著下調(diào)PNPLA2,LIPE,CD36和CPT1B基因的表達(dá)(P0.05)。同時(shí),過表達(dá)SCD1顯著上調(diào)了C16:1和C18:1的去飽和指數(shù)(P0.05)。2.設(shè)計(jì)合成針對(duì)SCD1基因的siRNA序列,檢測(cè)其干擾效率。當(dāng)乳腺細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向SCD1基因的siRNA后,顯著下調(diào)乳腺細(xì)胞中總甘油三酯的含量。實(shí)時(shí)定量結(jié)果表明,與對(duì)照組結(jié)果相比,干擾SCD1基因降低FASN,ACACA,LPIN1,DGAT1,DGAT2,LIPE,FABP3,PPARΑ和ACOX1基因的表達(dá)量(P0.05),并顯著上調(diào)CD36和CPT1B基因的表達(dá)(P0.05)。同時(shí),干擾SCD1基因下調(diào)了C18:1的去飽和指數(shù)(P0.05),但是對(duì)C16:1的去飽和指數(shù)沒有影響。3.克隆得到山羊SCD1基因5'側(cè)翼序列1778 bp。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),SCD1啟動(dòng)子含有TATA-box,位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游49 bp處,是構(gòu)成真核生物啟動(dòng)子的元件之一。在線預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)SCD1啟動(dòng)子含有NF-Y、AP-2、PPAR、SREBP、C/EBP和ER等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子片段缺失分析結(jié)果表明,SCD1啟動(dòng)子核心區(qū)域位于 411~ 355 bp。同時(shí),啟動(dòng)子核心區(qū)域存在Sp1、SRE和NF-Y等順式作用元件。4.定點(diǎn)缺失突變分析發(fā)現(xiàn),單個(gè)缺失SRE或NF-Y元件,SCD1啟動(dòng)子基礎(chǔ)活性與野生型相比顯著下降。過表達(dá)SREBF1對(duì)SCD1基因的表達(dá)量和啟動(dòng)子活性都有上調(diào)作用。干擾SREBF1抑制SCD1基因的表達(dá)并下調(diào)SCD1啟動(dòng)子活性。將NF-Y單獨(dú)突變或與SRE同時(shí)突變后,過表達(dá)SREBF1對(duì)SCD1啟動(dòng)子活性沒有影響。因此,SREBP1通過SRE和NF-Y元件調(diào)控SCD1啟動(dòng)子活性。5.LXRα激動(dòng)劑T0901317處理乳腺細(xì)胞能夠上調(diào)SCD1基因的表達(dá)水平以及C16:1和C18:1的去飽和指數(shù)。干擾LXRα對(duì)SCD1基因的mRNA水平?jīng)]有影響。干擾SREBF1同時(shí)添加T0901317顯著上調(diào)SCD1基因的表達(dá)。LXRα過表達(dá)引起SCD1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性上調(diào),但干擾LXRα對(duì)啟動(dòng)子活性沒有影響。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)SCD1啟動(dòng)子存在兩個(gè)LXRE位點(diǎn)。通過片段缺失和定點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn),突變LXRE不能阻止LXRα過表達(dá)對(duì)SCD1啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)作用。但是突變SRE和NF-Y元件后,LXRα過表達(dá)對(duì)SCD1啟動(dòng)子活性沒有影響。干擾SREBF1后,LXRα過表達(dá)不能上調(diào)SCD1啟動(dòng)子活性。SREBP1是維持SCD1啟動(dòng)子基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄活性的必需因子,LXRα則間接調(diào)控SCD1基因的轉(zhuǎn)錄活性。6.亞油酸處理山羊乳腺上皮細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SREBF1和SCD1基因的mRNA水平顯著下降,SCD1啟動(dòng)子活性也顯著下調(diào)。PUFA應(yīng)答元件在山羊、人和小鼠中非常保守。通過片段缺失和定點(diǎn)突變分析發(fā)現(xiàn),NF-Y元件突變后亞油酸對(duì)SCD1啟動(dòng)子活性無顯著影響。當(dāng)SCD1啟動(dòng)子上PUFA應(yīng)答元件內(nèi)SRE位點(diǎn)突變后,亞油酸處理細(xì)胞,同時(shí)添加T0901317對(duì)SCD1啟動(dòng)子活性沒有影響。亞油酸參與調(diào)控SCD1基因的轉(zhuǎn)錄活性是通過抑制SREBP1的表達(dá)發(fā)揮作用的。7.過表達(dá)PPARG1,同時(shí)用PPARG特異性激動(dòng)劑ROSI處理乳腺細(xì)胞,SCD1基因的mRNA水平及啟動(dòng)子活性顯著上調(diào)(P0.05)。通過片段缺失分析發(fā)現(xiàn),SCD1啟動(dòng)子上-29 bp處的PPRE位點(diǎn)對(duì)PPARG1的誘導(dǎo)具有重要作用,且該位點(diǎn)在山羊,人和小鼠上的保守性比較高。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行突變分析發(fā)現(xiàn),該元件是PPARG上調(diào)SCD1啟動(dòng)子活性所必需的元件。本研究表明,山羊SCD1能夠促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞中脂質(zhì)的積累。并發(fā)現(xiàn)山羊SREBP1對(duì)SCD1基因有直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用,而LXRα通過誘導(dǎo)SREBP1的表達(dá)間接調(diào)控SCD1基因轉(zhuǎn)錄。外源因子亞油酸則通過多種機(jī)制抑制SREBP1的表達(dá)來調(diào)控SCD1基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄因子PPARG能夠直接結(jié)合在SCD1啟動(dòng)子上誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄。本研究闡明了脂質(zhì)代謝相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子和外源因子參與調(diào)控SCD1基因轉(zhuǎn)錄的機(jī)制,為羊奶脂肪酸代謝調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S827
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本文編號(hào)：1626350