斜紋夜蛾（Spodoptera litura）是重要的農業(yè)害蟲,危害99科100多種植物,每年給我國農業(yè)生產(chǎn)造成嚴重損失,因此研發(fā)高效的斜紋夜蛾防治方法一直是科研工作者孜孜以求的目標。傳統(tǒng)化學防治方法會引起斜紋夜蛾產(chǎn)生嚴重抗性,且農藥殘留問題也一直是危害人類健康的潛在因素,所以迫切需要開發(fā)無公害防治斜紋夜蛾的方法。近年來,隨著基因組數(shù)據(jù)積累及基因編輯技術的發(fā)展,非模式昆蟲的基因功能解析以及靶標基因的篩選成為可能,為更好地開發(fā)害蟲生物防治方法提供了強有力的技術支撐。本研究旨在利用基因編輯技術研究斜紋夜蛾性別決定通路關鍵基因,進而開發(fā)出能夠防治斜紋夜蛾的有效方案。為達成這一目標進行了如下研究:第一,利用CRISPR/Cas9基因編輯技術,構建斜紋夜蛾基因組編輯平臺,為研究斜紋夜蛾基因功能奠定基礎;第二,尋找斜紋夜蛾性別決定通路和生殖調控方面關鍵基因,利用斜紋夜蛾基因組編輯平臺研究靶標基因功能;第三,構建斜紋夜蛾害蟲防治遺傳調控品系。相關研究成果可為斜紋夜蛾害蟲防治提供理論基礎和解決方案,具體研究內容和結果如下:1.基于CRISPR/Cas9技術的斜紋夜蛾基因組編輯平臺的構建CRISPR/Ca...

【文章頁數(shù)】：131 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
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第一章 緒論
    1.1 鱗翅目害蟲概述
    1.2 斜紋夜蛾概述
        1.2.1 斜紋夜蛾危害特點
        1.2.2 斜紋夜蛾發(fā)生危害規(guī)律
        1.2.3 斜紋夜蛾防控措施
    1.3 昆蟲種群遺傳調控技術的研究進展
        1.3.1 輻射不育技術研究進展
        1.3.2 遺傳調控技術研究進展
    1.4 昆蟲基因組編輯技術研究進展
        1.4.1 ZFNs技術研究進展
        1.4.2 TALENs技術研究進展
        1.4.3 CRISPR/Cas9 技術研究進展
        1.4.4 基因組編輯系統(tǒng)在害蟲種群控制方面的研究現(xiàn)狀
    1.5 研究目的和意義
        1.5.1 斜紋夜蛾基是一種世界性分布重要的農業(yè)害蟲
        1.5.2 斜紋夜蛾需要新的無公害防治方法
        1.5.3 構建斜紋夜蛾遺傳調控品系是害蟲防治的方向
    1.6 主要研究內容
        1.6.1 斜紋夜蛾基因組編輯平臺的構建
        1.6.2 斜紋夜蛾害蟲防治靶標基因的篩選
        1.6.3 利用基因組編輯平臺構建斜紋夜蛾防治品系
    1.7 技術路線
第二章 基于基因組編輯技術的斜紋夜蛾遺傳操作平臺構建
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 RNA提取
        2.2.3 cDNA的合成
        2.2.4 Ebony基因ORF序列的擴增
        2.2.5 系統(tǒng)進化樹的構建
        2.2.6 CRISPR/Cas9 基因組編輯技術方法
        2.2.7 表型觀察及基因組DNA突變檢測
        2.2.8 Real-Time PCR(RT-PCR)檢測
        2.2.9 斜紋夜蛾人工飼料的配制
    2.3 實驗結果
        2.3.1 斜紋夜蛾Ebony基因的序列和進化樹分析
        2.3.2 斜紋夜蛾Ebony基因時空表達譜分析
        2.3.3 斜紋夜蛾Ebony基因突變導致蛹殼顏色加深
        2.3.4 Ebony基因突變導致斜紋夜蛾成蟲顏色加深
        2.3.5 注射Cas9和sgRNA誘導的基因型
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 斜紋夜蛾性別決定關鍵基因Masc和 Doublesex功能研究.
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 RNA的提取
        3.2.3 cDNA的合成
        3.2.4 擴增Masc和 Doublesex基因的ORF序列
        3.2.5 系統(tǒng)進化樹的構建
        3.2.6 CRISPR/Cas9 基因組編輯技術方法
        3.2.7 表型觀察及基因組DNA突變檢測
        3.2.8 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)檢測
        3.2.9 數(shù)據(jù)分析
        3.2.10 Masc過表達質粒構建
        3.2.11 質粒大量提取與純化
        3.2.12 細胞轉染方法
        3.2.13 精子染色
    3.3 實驗結果
        3.3.1 SlMasc基因在BmN雌性卵巢細胞系的轉染
        3.3.2 過表達SlMasc基因導致雄性Doublesex剪接體出現(xiàn)
        3.3.3 CRISPR/Cas9 介導的SlMasc基因的突變檢測
        3.3.4 SlMasc基因突變導致雄性個體外生殖器畸形
        3.3.5 SlMasc基因突變導致雌性比例異常
        3.3.6 SlDoublesex基因進化保守性分析
        3.3.7 CRISPR/Cas9 介導的SlDoublesex基因突變
        3.3.8 SlDoublesex基因突變導致雌雄內外生殖器異常
        3.3.9 qPCR鑒定相關基因的表達
        3.3.10 SlDoublesex基因突變導致雌雄不育
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 基于基因組編輯技術的斜紋夜蛾不育品系的構建研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 RNA的提取
        4.2.3 cDNA的合成
        4.2.4 擴增Ser2和Osp基因的ORF序列
        4.2.5 CRISPR/Cas9 基因組編輯技術方法
        4.2.6 表型觀察及基因組DNA突變檢測
        4.2.7 Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)檢測
        4.2.8 數(shù)據(jù)分析
    4.3 實驗結果
        4.3.1 斜紋夜蛾Ser2 基因時空表達譜分析
        4.3.2 CRISPR/Cas9 介導的斜紋夜蛾Ser2 基因突變
        4.3.3 斜紋夜蛾Ser2 基因突變導致成蟲雄性不育
        4.3.4 Ser2 雄性不育可遺傳性檢測
        4.3.5 qPCR檢測Ser2 突變下游基因變化
        4.3.6 斜紋夜蛾Osp基因時空表達譜分析
        4.3.7 CRISPR/Cas9 介導的斜紋夜蛾Osp基因突變
        4.3.8 斜紋夜蛾Osp基因突變導致成蟲雌性不育
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 總結與展望
    5.1 研究總結
    5.2 主要創(chuàng)新點
    5.3 不足與展望
參考文獻
附錄一 實驗主要藥品試劑
附錄二 實驗主要儀器
附錄三 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文及參與的項目
致謝



本文編號：4007584