本文關(guān)鍵詞：線粒體分裂與鈣信號交互作用促進肝癌轉(zhuǎn)移的作用機制研究

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【摘要】：[研究背景]線粒體是細胞的“動力工廠”,供應細胞生存所需能量,氧自由基(ROS)產(chǎn)生、鈣離子穩(wěn)態(tài)、,除產(chǎn)生大量的ATP外、其在調(diào)節(jié)活性氧(ROS)產(chǎn)生、細胞色素C釋放介導的細胞凋亡、Ca~(2+)信號傳導的調(diào)節(jié)等多種生物學功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。最新的研究表明:在多種類型細胞中,線粒體通過可不斷的分裂融合改變其形狀進而適應各種環(huán)境刺激并滿足細胞功能需求。哺乳動物細胞中參與線粒體分裂的蛋白主要包括Drp1(dynamin-related protein-1)及其受體蛋白(FIS1、MFF、Mi D49和Mi D51),參與融合蛋白主要包括外膜融合蛋白MFN1(mitofusin1)、MFN2(mitofusin 2)和內(nèi)膜融合蛋白OPA l(opticatrophy 1)。近日,大量研究表明線粒體動態(tài)失衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。一些研究報告顯示,線粒體分裂/融合蛋白如DRP1,MFN1和MFN2的表達在肺癌、膀胱癌和乳腺癌中嚴重失衡,線粒體結(jié)構(gòu)的破壞對腫瘤細胞凋亡有重要影響。此外,研究表明肺癌患者預后較差與線粒體動力相關(guān)蛋白表達失衡顯著相關(guān)。我們前期研究表明,在肝癌組織DRP1表達上調(diào),而MFN1表達下調(diào),進而使線粒體分裂顯著增加。此外,我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn),線粒體分裂增加可通過ROS介導的NF-κB/p53信號通路促進肝癌細胞自噬和細胞存活。鈣離子是細胞內(nèi)最主要的第二信使之一,并參與調(diào)控幾乎所有的細胞生命活動。研究表明,鈣池操控的鈣攝取是非興奮性細胞最主要的鈣流入途徑。該過程主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣感受分子STIM1和細胞膜上的鈣通道蛋白Orai1共同介導完成。鈣信號的各種變化可被細胞解碼,進而參與調(diào)控包括腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移在內(nèi)的多種細胞活動。目前,線粒體分裂融合是否參與調(diào)控胞漿鈣信號以及是否影響在肝癌細胞遷移和轉(zhuǎn)移目前尚不明確。[研究目的]1、明確線粒體分裂融合與胞漿鈣離子之間存在交互調(diào)控環(huán)路;2、探討線粒體分裂融合與胞漿鈣信號交互調(diào)控的分子機制;3、明確線粒體分裂融合與胞漿鈣信號交互調(diào)控環(huán)路調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的作用機制。[研究方法]1、利用線粒體特異性染料Mitotracker Green和胞漿鈣離子特異性染料Fluo-4,檢測線粒體動態(tài)平衡與胞漿鈣信號之間的交互調(diào)控關(guān)系;2、利用Western blot和q PCR技術(shù)檢測線粒體分裂融合相關(guān)分子及其調(diào)控的相關(guān)信號通路分子的蛋白及mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化;3、利用流式細胞術(shù)證實線粒體分裂融合可調(diào)控胞漿內(nèi)ROS水平;4、利用免疫組化技術(shù)檢測線粒體分裂融合相關(guān)蛋白與SOCE重要調(diào)控分子STIM1之間的相關(guān)性;5、利用免疫熒光和鬼筆環(huán)肽染色技術(shù)檢測線粒體分裂融合與胞漿鈣離子交互調(diào)控環(huán)路對肝癌細胞粘著斑和偽足形成的影響;6、利用Transwell實驗檢測線粒體分裂融合與胞漿鈣穩(wěn)態(tài)失衡可調(diào)控肝癌細胞的侵襲能力;7、利用載體構(gòu)建和熒光素報告檢測技術(shù)檢測線粒體分裂關(guān)鍵分子Drp1和FIS1的轉(zhuǎn)錄因子位置;8、利用公共數(shù)據(jù)分析調(diào)控線粒體分裂關(guān)鍵分子Drp1和FIS1轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子有哪些;9、利用裸鼠肝原位成瘤技術(shù)檢測線粒體分裂關(guān)鍵分子Drp1對肝癌轉(zhuǎn)移的影響;10、利用HE染色技術(shù)檢測成瘤裸鼠肝癌肝內(nèi)和肺組織轉(zhuǎn)移情況;[研究結(jié)果]1、線粒體形態(tài)和胞漿鈣信號檢測結(jié)果表明線粒體分裂與胞漿鈣信號可正反饋交互調(diào)控;2、細胞內(nèi)ROS水平檢測結(jié)果表明線粒體分裂可促進胞漿鈣信號水平激活;3、Western blot和q PCR實驗結(jié)果顯示線粒體分裂與胞漿鈣信號可通過Ca MKII/ERK/FAK信號通路調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移情況;4、轉(zhuǎn)錄因子預測實驗結(jié)果顯示胞漿鈣信號通過調(diào)控Drp1和FIS1轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)控線粒體分裂融合狀;5、進一步免疫組化結(jié)果表明在肝癌組織中Drp1與STIM1分子表達顯著正相關(guān),而MFN1分子與STIM1分子表達顯著負相關(guān);6、同時粘著斑和細胞骨架檢測結(jié)果進一步表明線粒體動態(tài)與胞漿鈣穩(wěn)態(tài)失衡正反饋交互調(diào)控環(huán)路可縮短肝癌細胞粘著斑的生成周期并且可促進偽足的形成;7、Transwell實驗結(jié)果表明線粒體分裂與鈣信號交互調(diào)控環(huán)路可促進肝癌細胞的侵襲;8、裸鼠肝原位成瘤結(jié)果及成瘤裸鼠肝肺組織HE染色結(jié)果表明線粒體分裂與鈣信號交互調(diào)控環(huán)路可促進肝癌轉(zhuǎn)移;[研究結(jié)論]本研究明確了線粒體分裂與鈣信號存在正反饋交互調(diào)控環(huán)路,并且這一環(huán)路可以促進肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。
【關(guān)鍵詞】：Drp1 線粒體功能 ROS NF-kB
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 縮略語表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-13
• 文獻回顧13-20
• 1 腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制研究13-14
• 2 線粒體分裂融合的研究現(xiàn)狀14-18
• 3 胞漿鈣信號的研究現(xiàn)狀18-20
• 第一部分 線粒體分裂調(diào)控胞漿鈣信號的分子機制研究20-48
• 1 材料20-26
• 2 方法26-36
• 3 結(jié)果36-47
• 4 討論47-48
• 第二部分 胞漿鈣信號調(diào)控線粒體分裂的分子機制研究48-66
• 1 材料48-52
• 2 方法52-57
• 3 結(jié)果57-64
• 4 討論64-66
• 第三部分 線粒體分裂與胞漿鈣信號交互調(diào)控環(huán)路促進肝癌轉(zhuǎn)移的作用機制研究66-76
• 1 試劑66
• 2 方法66-69
• 3 結(jié)果69-74
• 4 討論74-76
• 第四部分 線粒體分裂抑制劑Mdivi-1 抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用機制研究76-85
• 1 材料76-78
• 2 實驗方法78-81
• 3 結(jié)果81-83
• 4 討論83-85
• 小結(jié)85-88
• 參考文獻88-91
• 附錄91-94
• 個人簡歷和研究成果94-96
• 致謝96

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本文編號：812351