本文關(guān)鍵詞：B7-H4在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)意義研究

  更多相關(guān)文章： B7-H4 相互作用蛋白 差異表達(dá)蛋白 核定位序列

【摘要】：B7-H4,又稱B7x和B7S1,是B7家族共刺激分子成員之一,并且能夠抑制T細(xì)胞的免疫功能。B7-H4分子mRNA在人體外周組織中廣泛表達(dá),而其蛋白在正常機(jī)體內(nèi)則不表達(dá)或低表達(dá),在眾多腫瘤細(xì)胞中則呈高表達(dá)。此外,研究發(fā)現(xiàn)B7-H4的表達(dá)水平與疾病的惡化呈正相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn),B7-H4分子屬于I型跨膜糖蛋白,與淋巴細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合,從而負(fù)性調(diào)控免疫反應(yīng)。然而在一些腫瘤細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了B7-H4在胞內(nèi)的表達(dá)。臨床組織樣本的分析結(jié)果顯示,膜表達(dá)B7-H4與腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),而胞內(nèi)表達(dá)B7-H4分子與腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞無明顯相關(guān)性,由此可見,胞內(nèi)B7-H4分子有區(qū)別于膜表達(dá)B7-H4分子的生物學(xué)功能。近期研究表明,B7-H4分子含有核定位序列,能夠穿梭于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間;并且位于核內(nèi)的B7-H4分子能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、G1/S期的轉(zhuǎn)換。但是,對(duì)于B7-H4分子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)意義仍不十分清楚。本研究通過構(gòu)建Flag標(biāo)簽的B7-H4野生型(B7-H4 WT)真核表達(dá)載體,瞬轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞,采用免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜的方法,尋找B7-H4分子在細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白;并通過基因芯片的方法分析構(gòu)建的B7-H4野生型(B7-H4 WT)與核定位序列突變B7-H4(B7-H4 H250Q)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,從而尋找B7-H4 WT與B7-H4 H250Q分子所引起的差異表達(dá)蛋白,更好地研究B7-H4在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的生物學(xué)意義。本論文主要包括以下兩部分內(nèi)容:一、免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜法尋找B7-H4分子相互作用蛋白及其生物學(xué)功能的初步研究【目的】尋找B7-H4分子相互作用蛋白,并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行初步研究�！痉椒ā繕�(gòu)建Flag標(biāo)簽的B7-H4野生型真核表達(dá)載體,通過lipofectamine2000瞬轉(zhuǎn)HEK293,24-48h提取總蛋白,免疫共沉淀法獲得與B7-H4分子相互作用的蛋白,將相互作用蛋白跑WB并銀染,差異條帶膠回收,打質(zhì)譜,分析數(shù)據(jù),尋找相互作用蛋白,免疫共沉淀驗(yàn)證相互作用蛋白;以及通過構(gòu)建vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行相應(yīng)功能實(shí)驗(yàn)�！窘Y(jié)果】構(gòu)建了Flag標(biāo)簽的B7-H4野生型質(zhì)粒,以及vector/786-O、B7-H4WT/786-O、B7-H4 H250Q/786-O以及vector/293、B7-H4 WT/293、B7-H4 H250Q/293穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜找到了野生型B7-H4分子的相互作用蛋白,并且發(fā)現(xiàn)B7-H4分子對(duì)相互作用蛋白的活性有調(diào)控作用。【結(jié)論】確定了B7-H4分子的互作蛋白DNA-PKcs,并初步證實(shí)B7-H4對(duì)該蛋白的活性有調(diào)控作用。二、尋找B7-H4野生型(B7-H4 WT)及核定位序列突變型(B7-H4 H250Q)在786-O細(xì)胞中的差異表達(dá)蛋白及其功能研究【目的】尋找B7-H4分子引起的差異表達(dá)蛋白,并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行研究�！痉椒ā客ㄟ^基因芯片技術(shù)對(duì)上述構(gòu)建的vector/786-O、B7-H4 WT/786-O、B7-H4H250Q/786-O穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株進(jìn)行分析,尋找差異表達(dá)基因,Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白,MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)比較體外細(xì)胞增殖率的差異�！窘Y(jié)果】Western blot結(jié)果與基因芯片結(jié)果均發(fā)現(xiàn)一些與細(xì)胞侵襲及血管生成相關(guān)的差異表達(dá)蛋白,MTT增殖實(shí)驗(yàn)則表明B7-H4 WT增殖率要高于vector及B7-H4H250Q�！窘Y(jié)論】野生型B7-H4分子能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,并且能夠上調(diào)一些與細(xì)胞侵襲及血管生成密切相關(guān)的蛋白的表達(dá),并且這一作用是由其核定位序列所介導(dǎo)的。
【關(guān)鍵詞】：B7-H4 相互作用蛋白 差異表達(dá)蛋白 核定位序列
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 引言10-12
• 第一部分 免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜法尋找B7-H4分子相互作用蛋白及其生物學(xué)功能的初步研究12-29
• 1 材料12-14
• 1.1 主要試劑12-13
• 1.2 主要溶液的配置13-14
• 1.3 實(shí)驗(yàn)儀器14
• 1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株14
• 2 實(shí)驗(yàn)方法14-20
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)14-15
• 2.2 重組Flag標(biāo)簽質(zhì)粒載體的構(gòu)建15-17
• 2.3 重組質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)HEK293細(xì)胞17
• 2.4 免疫共沉淀（CoIP）尋找相互作用蛋白17-18
• 2.5 銀染法尋找B7-H4相互作用蛋白18
• 2.6 差異蛋白膠內(nèi)酶解18-19
• 2.7 慢病毒法構(gòu)建B7-H4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株19
• 2.8 嘌呤霉素最適作用濃度的篩選19
• 2.9 博來霉素zeocin作用濃度的篩選19-20
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-26
• 3.1 pCMV-Tag2B-B7-H4 WT重組質(zhì)粒的鑒定20-21
• 3.2 免疫共沉淀（CoIP）結(jié)果21-22
• 3.3 差異條帶銀染結(jié)果22
• 3.4 質(zhì)譜結(jié)果22-23
• 3.5 免疫共沉淀驗(yàn)證相互作用23
• 3.6 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建23-25
• 3.7 博來霉素zeocin作用濃度的確定25-26
• 3.8 B7-H4分子對(duì)其相互作用蛋白DNA-PKcs活性的影響26
• 4 討論26-29
• 第二部分 尋找B7-H4野生型及核定位序列突變型在 786O中的差異表達(dá)蛋白及其功能研究29-38
• 1 材料29-30
• 1.1 主要試劑29-30
• 1.2 主要儀器30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法30-31
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)30
• 2.2 Trizol法提取總RNA30-31
• 2.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)31
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析31
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-36
• 3.1 基因芯片結(jié)果31-33
• 3.2 蛋白水平檢測(cè)差異基因表達(dá)33-35
• 3.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率35-36
• 4 討論36-38
• 論文總結(jié)38-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 綜述42-55
• 參考文獻(xiàn)48-55
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文55-56
• 附錄56-57
• 致謝57-58

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本文編號(hào)：812245