本文關(guān)鍵詞：循環(huán)肝癌細(xì)胞CD147表型鑒定在指導(dǎo)利卡汀個體化治療中的應(yīng)用潛能探索

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【摘要】：研究背景和目的肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC,以下簡稱肝癌)是全球第三大腫瘤致死性疾病,在我國每年因肝癌或其相關(guān)疾病而死亡的人數(shù)達(dá)13萬人次。手術(shù)仍然是目前最有效的肝癌治療手段。然而,由于肝癌起病隱匿,發(fā)展迅速,往往在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,喪失了手術(shù)機(jī)會,因此越來越多的患者接受非手術(shù)治療,如經(jīng)肝動脈化療栓塞術(shù)(Transcatheter arterial chemoembolization, TACE)。利卡汀(Licartin)是一個同位素標(biāo)記的單克隆抗體,其靶點(diǎn)是包括肝癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的CD147蛋白。通過介入手段進(jìn)入腫瘤內(nèi),利卡汀除了特異性與肝癌細(xì)胞表面CD147結(jié)合封閉其相關(guān)信號通路外,自身荷載的放射性1311也通過釋放β射線直接殺傷肝癌細(xì)胞。作為一個放射免疫治療的靶向藥物,利卡汀自上市以來得到了較多關(guān)注,其發(fā)揮的臨床療效也得到了認(rèn)可,多組臨床數(shù)據(jù)表明TACE+利卡汀聯(lián)合方案優(yōu)于單純的TACE治療。然而,我們注意到,對于這樣一個分子靶向藥物,臨床上并沒有建立和應(yīng)用指導(dǎo)利卡汀個體化治療的實(shí)驗(yàn)室篩查技術(shù)。至于受檢樣本,在接受非手術(shù)治療的肝癌患者無法獲取或需要反復(fù)獲取肝癌樣本的情況下,傳統(tǒng)的手術(shù)切除或活檢樣本并不能滿足要求,而我們認(rèn)為有“液體活檢”(Liquid biopsy)之稱的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cells, CTCs)可能是理想的可替代檢測樣本。近年來,我們逐步建立和優(yōu)化了肝癌CTCs分離和鑒定技術(shù)。在富集肝癌CTCs方面,選擇Ficoll密度梯度離心結(jié)合磁性激活細(xì)胞分選術(shù)(Magnetic activated cell separation, MACS)分選方法中的去除分選策略。通過CD45磁珠標(biāo)記血液中的淋巴細(xì)胞,經(jīng)過分選磁場時(shí)被標(biāo)記的淋巴細(xì)胞被吸附滯留于磁場中的分選柱中,而未被標(biāo)記的細(xì)胞(含CTCs)則流出分離柱而被收集。這一策略減低了腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性對陽性分選效率的影響。在鑒定肝癌CTCs標(biāo)志物的選擇上,我們在比較多個指標(biāo)后選擇了具有肝癌細(xì)胞特異性表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體(Asialoglycoproteinreceptor, ASGPR)和氨甲酰磷酸合成酶1 (Carbamyl phosphate synthetase 1, CPS1)的混合指標(biāo),有助于提高鑒定的陽性率。在建立并驗(yàn)證多色免疫熒光染色方法的可行性時(shí),我們除了選取利卡汀的靶點(diǎn)CD147外,還選取了上皮細(xì)胞粘附分子(Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM),這一在肝癌中可能作為肝癌干細(xì)胞樣標(biāo)志的蛋白作為另一個鑒定的目的蛋白。在評價(jià)該方法的可行性后,選擇經(jīng)利卡汀治療的肝癌患者,檢測肝癌CTCs CD147表達(dá)情況,并結(jié)合肝癌患者臨床隨訪資料,探討肝癌CTCs的CD147分子表型鑒定對于指導(dǎo)臨床利卡汀個體化治療的應(yīng)用價(jià)值。方法1、建立多色免疫熒光染色技術(shù)分析肝癌CTCs表達(dá)CD147或EpCAM的方法學(xué),并研究CTCs與組織樣本之間CD147分子表型的相關(guān)性。(1)采用Ficoll密度梯度離心結(jié)合MACS去除分選方法富集肝癌CTCs血液模型。(2)應(yīng)用ASGPR+CPS1/CD147或EpCAM/CD45四抗體(分三組,三色)建立鑒定肝癌CTCs表達(dá)目的蛋白的四色免疫細(xì)胞熒光染色方法(第四色為細(xì)胞核襯染)。(3)采用上述方法四色免疫細(xì)胞熒光染色方法檢測32例肝癌患者CTCs中CD147或EpCAM表達(dá)情況,了解肝癌CTCs的CD147、EpCAM表達(dá)譜。(4)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測對應(yīng)32例肝癌組織的CD147表達(dá)情況,比較肝癌CTCs與對應(yīng)肝癌組織CD147表達(dá)檢測結(jié)果,分析二者之間的相關(guān)性。2、檢測92例接受TACE+利卡汀治療或TACE單純治療的肝癌患者CTCs及其CD147表達(dá),比較治療前后CTCs數(shù)量以及CD147表達(dá)譜變化情況,收集并統(tǒng)計(jì)相關(guān)臨床資料以及隨訪生存信息,分析并評價(jià)肝癌CTCs計(jì)數(shù)及其CD147分子分型在指導(dǎo)利卡汀個體化治療中的應(yīng)用潛能。結(jié)果1、ASGPR+CPS1/CD45鑒定指標(biāo)可準(zhǔn)確鑒別出富集樣品中的肝癌CTCs,而基于多色免疫熒光染色技術(shù)可以準(zhǔn)確檢測不同CTCs中CD147或EpCAM的表達(dá)差異。在受檢的32例肝癌患者中,29例為CTCs陽性,占91%。每5mL血液樣本中檢出CTCs數(shù)目最少為4個,最多可達(dá)62個,平均28±16個。而15例健康志愿者和12例其他惡性腫瘤患者外周血中均未檢出CTCs。在29例CTCs陽性患者中,20例檢出CD147+ CTCs,占69%,5例檢出EpCAM+ CTCs,占17%。而在檢出CD147+或EpCAM+ CTCs的個體中,也發(fā)現(xiàn)有不等量的CD147-或EpCAM- CTCs的存在。2、在對比研究的32例患者中,29例患者可檢出CTCs,陽性率達(dá)91%。我們定義凡發(fā)現(xiàn)有CD147+或EpCAM+的CTCs存在,其對應(yīng)的患者即為CD147+或EpCAM+個體。在29例CTCs陽性患者中,有20例(69%)患者CTCs中存在CD147+CTCs細(xì)胞,5例(17%)中存在EpCAM+細(xì)胞CTCs。在29例CTCs陽性患者對應(yīng)的肝癌組織中,有22例(76%)為CD147+。對比兩種樣本中CD147檢測結(jié)果,共有27例兩種樣本的檢測結(jié)果一致,其中有20例,兩種檢測結(jié)果檢出均為CD147+,7例均為CD147-個體,總符合率達(dá)93.1%(27/29)。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示兩種樣本的檢測方法檢測結(jié)果無明顯差異性(P0.05)。3、檢測52例接受TACE+利卡汀和40例接受TACE單純治療(TACE組)的肝癌患者(共計(jì)92例)CTCs及其CD147表達(dá)情況。結(jié)果顯示,86例患者為CTCs陽性,6例未檢出CTCs, CTCs陽性率達(dá)93%。TACE組95.0%(38/40)患者為CTCs陽性,CTCs檢出數(shù)5-76個,平均38±15；而TACE+利卡汀組92.3%(48/52)患者為CTCs陽性,CTCs檢出數(shù)2-78個,平均36±13個；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩組患者CTCs陽性率及數(shù)目無明顯差異(P0.05)。4、對86例CTCs陽性患者進(jìn)行CTCs CD147分子分型,結(jié)果顯示,58例為CD147+,陽性率為67%(58/86)。其中33例在TACE+利卡汀組,陽性率為69%(33/48)；25例在TACE組,陽性率為66%(25/38)。不同患者和同一患者不同CTCs之間CD147表達(dá)不同,在CD147+CTCs存在的患者中檢測出CTCs中CD147+細(xì)胞所占比率也不盡相同,其外周血中也并且存在CD147-的CTCs。5、86例CTCs陽性患者接受治療后1個月,外周血CTCs均有不同程度的下降。在TACE+卡汀組(n=48),CTCs數(shù)目從治療前36±13個下降到治療后21±11個,差異具有顯著性(P0.001)。CD147+患者(n=33)在治療前后的CTCs數(shù)目(38±12個 vs.19±9個)變化存在顯著差異性(P0.001),而CD147-患者(n=15)在治療前后的CTCs數(shù)目(30±11個vs.26±13個)變化無顯著差異(P=0.343)。對比CD147+和CD147-兩種表型患者在接受治療前后CTCs數(shù)目差值之間(19±8個vs.4±8個)具有顯著差異性(P0.001),提示CD147+患者對利卡汀敏感。在TACE組(n=38),CTCs數(shù)目從治療前38±15個下降到治療后29±16個,差異具有顯著性(P=0.018),而對比CD147+患者(n=25)和CD147-患者(n=13)治療前后CTCs數(shù)目差值之間(10±8個vs.6±10個)未見顯著差異(P=0.252)。6、TACE+利卡汀組(n=48)和TACE組(n=38)CTCs數(shù)目之間在治療前(36±13個vs.38±15個)無顯著差異性(P=0.524),而在治療后2組CTCs數(shù)值變化之間(14±11個vs.9±9個)顯示出顯著差異性(P=0.009)。CD147+患者在不同治療組(TACE+利卡汀組33例,TACE組25例)的療效：治療前CTCs數(shù)目(38±12個 vs.42±14個)無顯著差異性(P=0.247),治療后2組CTCs數(shù)目變化之間(19±8個 vs.10±8個)顯示出顯著差異性(P0.001),而CD147-患者(TACE+利卡汀組15例,TACE組13例)治療后CTCs數(shù)目變化之間(4±8個vs.6±10個)無顯著差異性(P=0.549)。結(jié)論本研究建立的多色免疫熒光染色方法簡便實(shí)用,可用于肝癌CTCs CD147或EpCAM表型鑒定。肝癌CTCs可替代肝癌組織樣本進(jìn)行CD147分子表型檢測。不同肝癌個體及同一肝癌個體不同CTCs之間CD147表達(dá)顯示出異質(zhì)性。肝癌CTCsCD147表型檢測可能有助于指導(dǎo)臨床利卡汀的個體化治療,以及進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測和實(shí)時(shí)療效評價(jià)。對CD147+患者推薦積極應(yīng)用利卡汀治療,而對CD147-患者則不推薦。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 循環(huán)腫瘤細(xì)胞 CD147 利卡汀 個體化治療
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 前言13-17
• 第一部分 循環(huán)肝癌細(xì)胞CD147、EpCAM表型鑒定的方法學(xué)建立17-29
• 、材料和方法17-23
• 二、結(jié)果23-27
• 三、討論27-29
• 第二部分 循環(huán)肝癌細(xì)胞CD147分子鑒定在指導(dǎo)利卡汀個體化治療應(yīng)用潛能的研究29-41
• 一、材料和方法29-30
• 二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-38
• 三、討論38-41
• 全文小結(jié)41-42
• 基金資助42-43
• 參考文獻(xiàn)43-46
• 文獻(xiàn)綜述一 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤患者血液高凝狀態(tài)的關(guān)系46-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 文獻(xiàn)綜述二 循環(huán)肝癌細(xì)胞的研究進(jìn)展和技術(shù)問題55-61
• 文獻(xiàn)綜述三61-67
• 縮略詞表67-68
• 在讀期間參加科研工作和發(fā)表論文情況68-69
• 致謝69-70

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