本文關(guān)鍵詞：硫酸軟骨素共價修飾PAMAM傳遞miR-34a治療CD44陽性腫瘤的研究

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【摘要】：microRNA （miRNA）是非編碼，具有調(diào)節(jié)功能的小片段RNA。microRNA-34a (miR-34a)是研究較為深入的miRNA，位于p53信號通路下游，在大多數(shù)腫瘤細胞中被顯著下調(diào)。增加細胞內(nèi)的miR-34a可以通過靶向Notch-1和Bcl-2的mRNA抑制腫瘤細胞的增殖、遷移并且誘導(dǎo)細胞凋亡。為了提高miR-34a的細胞遞送效率，構(gòu)建靶向型、高效性的遞釋系統(tǒng)。聚酰胺胺（PAMAM）是高效率低毒性的細胞轉(zhuǎn)染生物納米載體，但是其缺乏靶向性，不能有效的聚集在腫瘤部位。硫酸軟骨素是內(nèi)源性多糖，對在許多實體瘤細胞膜過表達的CD44蛋白具有很高的親和性。因此，本文用硫酸軟骨素共價修飾PAMAM，形成新的靶向CD44陽性腫瘤細胞的納米載體，高效率的遞送miR-34a。 硫酸軟骨素通過邁克爾加成反應(yīng)和PAMAM納米載體共價結(jié)合，形成PAMAMCS納米載體，并且經(jīng)核磁1H譜驗證其合成。PAMAMCS和miR-34a通過靜電作用組裝成納米復(fù)合物PAMAMCS/miR-34a，粒徑和電位分別是112.5nm和+16.5mV。在質(zhì)量比8:1時，PAMAMCS完全裝載miR-34a，并且保護核酸免受血清的降解。PAMAMCS/miR-34a通過CD44和網(wǎng)格蛋白雙重細胞內(nèi)吞機制高效率把miR-34a傳遞進入CD44高表達的腫瘤細胞系。經(jīng)過PAMAMCS/miR-34a的轉(zhuǎn)染，p53缺失型的前列腺癌細胞系PC-3和胰腺癌細胞系MIApaca-2的早期凋亡細胞比率分別是29.61%和21.19%，p53野生型細胞系A(chǔ)549早期凋亡細胞是12.1%；蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染了PAMAMCS/miR-34a的三種細胞， Bcl-2的表達量下調(diào)，與凋亡相關(guān)的Procaspase-3，PARP-1被激活剪切。轉(zhuǎn)染了PAMAMCS/miR-34a的三種腫瘤細胞的細胞周期中G1期所占比例上升；并且Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果顯示，PAMAMCS/miR-34a樣品組的腫瘤細胞增殖率和遷移率相比于陰性都顯著的下降。本實驗合成的PAMAMCS納米載體物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，，保護核酸免受血清降解，并且通過網(wǎng)格蛋白和CD44雙重胞吞機制進入細胞。通過靜電作用組裝的PAMAMCS/miR-34a納米復(fù)合物可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，阻滯細胞周期在G1期。并且研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a雖然位于p53信號通路下游，但是不依賴于p53蛋白，獨立調(diào)控下游信號通路。本研究在腫瘤的靶向治療提供了材料基礎(chǔ)，并為抑制腫瘤的多藥耐藥性和靶向腫瘤干細胞的治療提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：CD44 miR-34a 腫瘤 硫酸軟骨素 PAMAM
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R73-36
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 緒論11-28
• 1.1 腫瘤的靶向治療11-12
• 1.2 分子靶向治療12-16
• 1.2.1 p53 基因藥物12-13
• 1.2.2 寡核苷酸藥物13-16
• 1.3 microRNA-34a 的概述16-18
• 1.3.1 miR-34a 和腫瘤細胞增殖的關(guān)系16-17
• 1.3.2 miR-34a 和腫瘤細胞凋亡的關(guān)系17
• 1.3.3 miR-34a 和腫瘤細胞周期17
• 1.3.4 miR-34a 和腫瘤細胞遷移17-18
• 1.3.5 miR-34a 和腫瘤干細胞18
• 1.4 寡核苷酸傳遞系統(tǒng)面臨的困難18-19
• 1.5 納米靶向遞送體系19-24
• 1.5.1 納米材料19
• 1.5.2 腫瘤的被動靶向19-20
• 1.5.3 納米載體的主動靶向20-22
• 1.5.4 CD4422-24
• 1.5.5 硫酸軟骨素24
• 1.6 PAMAM 納米材料概述24-26
• 1.7 本文研究內(nèi)容和創(chuàng)新點26-28
• 第二章 材料和方法28-38
• 2.1 細胞株28
• 2.2 材料28-29
• 2.2.1 核酸序列28
• 2.2.2 主要試劑28-29
• 2.3 實驗儀器29
• 2.4 主要試劑的配制29-31
• 2.5 實驗方法31-36
• 2.5.1 載體的合成31
• 2.5.2 納米粒徑的測量31
• 2.5.3 凝膠阻滯和核酸保護實驗31-32
• 2.5.4 細胞培養(yǎng)32
• 2.5.5 納米復(fù)合物組裝32
• 2.5.6 MTT 法檢測細胞存活率32-33
• 2.5.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡33
• 2.5.8 細胞周期的測定33-34
• 2.5.9 Transwells 檢測細胞的遷移34
• 2.5.10 劃痕實驗檢測細胞遷移率34
• 2.5.11 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測凋亡相關(guān)蛋白34-36
• 2.5.12 流式細胞檢測細胞的 CD44 表達量36
• 2.5.13 流式細胞儀檢測納米載體的靶向性36
• 2.5.14 納米載體復(fù)合物進入細胞的胞吞機制研究36
• 2.6 激光共聚焦36-37
• 2.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析37-38
• 第三章 結(jié)果和討論38-57
• 3.1 PAMAMCS 的合成和粒度電位38-39
• 3.2 納米復(fù)合物組裝和核酸保護39-42
• 3.3 納米載體胞吞機制和靶向性的研究42-47
• 3.4 納米復(fù)合物抑制腫瘤細胞的增殖47-49
• 3.5 納米復(fù)合物對腫瘤細胞的周期阻滯49-51
• 3.6 納米復(fù)合物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡51-54
• 3.7 納米復(fù)合物影響腫瘤細胞的遷移54-57
• 第四章 結(jié)論和展望57-58
• 參考文獻58-64
• 致謝64-65
• 附錄65-66

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6 劉丹;胡海洋;張潔;唐星;陳大為;;pH敏感PAMAM樹狀大分子復(fù)合物膠束的制備及性質(zhì)研究[J];沈陽藥科大學(xué)學(xué)報;2011年02期

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本文編號：770899