本文關(guān)鍵詞：糖基化聚氨基葡糖增強(qiáng)光動(dòng)力治療免疫效應(yīng)的初步探討

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【摘要】：研究背景近年來(lái),惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì),嚴(yán)重威脅人類健康。各項(xiàng)數(shù)據(jù)表明,癌癥儼然成為人類的第一殺手,控制癌癥成為世界各國(guó)政府的衛(wèi)生戰(zhàn)略重點(diǎn),癌癥的綜合治療成為世界所關(guān)注的研究課題。在惡性腫瘤的諸多治療方法中,光動(dòng)力治療(Photodynamic Therapy,PDT)是一種有著良好應(yīng)用前景的研究新領(lǐng)域。自PDT問(wèn)世以來(lái),以其安全、有效、副作用小、可重復(fù)性、相對(duì)成本低和可協(xié)同性等優(yōu)點(diǎn)在腫瘤的治療中顯示出很強(qiáng)的生命力。PDT在臨床應(yīng)用中取得令人矚目的成就,對(duì)于部分癌前病變、早期惡性腫瘤病例能夠達(dá)到治愈的目的,并且為中晚期癌癥患者,特別是拒絕(或無(wú)法)采用傳統(tǒng)治療方法者提供了一種新的治療選擇。目前很多國(guó)家開(kāi)展了腫瘤PDT的研究,并使眾多癌癥患者受惠于這一治療方法。它的應(yīng)用不僅在于體表腫瘤,對(duì)呼吸道、胃腸道、顱內(nèi)、眼、膀胱等部位的腫瘤也取得了良好的治療效果。光動(dòng)力治療是利用光敏劑在不同組織中半衰期不同,在一定時(shí)間內(nèi)形成光敏劑選擇性滯留于腫瘤組織內(nèi),在此時(shí)間段內(nèi)通過(guò)特定波長(zhǎng)的激光照射腫瘤局部,以激活光敏劑,使其與腫瘤組織內(nèi)的氧分子發(fā)生光化學(xué)作用,產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的單態(tài)氧(1O2)及其他活性氧物質(zhì)(radical oxygen species, ROS),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子發(fā)生氧化損傷,從而起到如下作用：1.直接的細(xì)胞殺傷效應(yīng)；2.引起腫瘤組織中微血管的破壞,造成局部缺血缺氧導(dǎo)致細(xì)胞死亡；3.局部的氧化應(yīng)激反應(yīng)激活補(bǔ)體系統(tǒng)、促使多種炎癥及免疫因子的產(chǎn)生和釋放,誘導(dǎo)各種炎性細(xì)胞、免疫細(xì)胞快速浸潤(rùn)至腫瘤局部,最后形成全身性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。它包含了3個(gè)不可或缺的成分：1.系統(tǒng)或局部應(yīng)用的光敏劑：2.與光敏劑最大吸收波長(zhǎng)相適應(yīng)的近紅外激光；3.能夠在激發(fā)后變成單態(tài)氧(102)的分子氧。然而,PDT也有其自身的局限性,如現(xiàn)有光動(dòng)力技術(shù)的殺傷深度有限,腫瘤消退后復(fù)發(fā)率高,對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶治療效果有限等。為了克服這些弊端,研究者們開(kāi)始關(guān)注于PDT與免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用,試圖通過(guò)提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性或加強(qiáng)激活宿主自身免疫系統(tǒng),以主動(dòng)免疫應(yīng)答的方式,激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫,以期達(dá)到治療腫瘤和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的目的。激光免疫療法(laser immunotherapy, LIT)是1997年美國(guó)俄克拉何馬州大學(xué)的Chen等適時(shí)提出的,其基本原理是通過(guò)光導(dǎo)纖維將特定波長(zhǎng)的激光輻照于腫瘤組織局部,以激發(fā)選擇性滯留在腫瘤組織中的光敏劑從而產(chǎn)生光化學(xué)、光物理效應(yīng),局部殺傷腫瘤細(xì)胞；同時(shí)瘤內(nèi)注射免疫佐劑,受損的腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤抗原能夠與免疫佐劑結(jié)合形成特殊的腫瘤疫苗,激活機(jī)體特異性免疫系統(tǒng),從而達(dá)到殺滅原發(fā)腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤的目的,并且產(chǎn)生免疫記憶。研究目的1.探討經(jīng)典光敏劑Photofrin介導(dǎo)的光動(dòng)力療法在體外對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT6的殺傷作用特點(diǎn),以尋找糖基化聚氨基葡糖(glycated chitosan, GC)激光免疫療法的理想作用參數(shù)。2.在小鼠EMT6乳腺癌模型上,觀察激光免疫治療三要素(光敏劑、激光、免疫佐劑)不同組合方式的治療方法對(duì)小鼠EMT6腫瘤的抑制效應(yīng)及對(duì)荷瘤小鼠生存的影響。治愈小鼠再次接種相同數(shù)量的EMT6細(xì)胞,觀察是否有腫瘤形成及其生長(zhǎng)情況,探討激光免疫治療的長(zhǎng)期抗瘤效應(yīng)。3.觀察不同處理后EMT6腫瘤誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、熱休克蛋白70(HSP70)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、活化的凋亡蛋白3(Actived-Caspase3)表達(dá)的差異及CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和表達(dá)細(xì)胞毒性標(biāo)志顆粒酶B陽(yáng)性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)差異,以比較各組氧化應(yīng)激、凋亡水平和細(xì)胞免疫效應(yīng)強(qiáng)度的差異。4.在小鼠4T1轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型上,比較激光免疫治療和光動(dòng)力治療對(duì)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移瘤的預(yù)防和治療作用,并比較各組荷瘤小鼠的脾系數(shù),證實(shí)免疫系統(tǒng)的參與。研究方法和內(nèi)容1.利用熒光顯微鏡下觀察和多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值的方法研究Photofrin在EMT6細(xì)胞中的吸收情況。通過(guò)MTT法檢測(cè)PDT療效三大影響因素(光敏劑濃度及孵育時(shí)間、功率密度、能量密度)對(duì)光動(dòng)力細(xì)胞殺傷效應(yīng)的影響。2.建立BALB/c小鼠臀部皮下EMT6乳腺癌模型,取瘤體合格小鼠分為6組(PDT+GC組、PDT組、Laser+GC組、Laser組、GC組、Control組),分別接受相應(yīng)的激光免疫治療三要素(光敏劑、激光、免疫佐劑)不同組合方式的治療,隔天測(cè)量腫瘤體積并記錄小鼠死亡時(shí)間,繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和荷瘤小鼠的生存曲線,比較各組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況及生存時(shí)間。其中局部瘤體及轉(zhuǎn)移瘤消失小鼠繼續(xù)觀察,至治療后90天仍存活且未出現(xiàn)復(fù)發(fā)者視為治愈小鼠。對(duì)治愈小鼠,再次接種與首次接種數(shù)目相同的EMT6腫瘤細(xì)胞,觀察是否有腫瘤生長(zhǎng)及其增長(zhǎng)情況。3.于治療后2天(48h)每組取3只小鼠,通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫印跡的方法,比較不同處理后腫瘤組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、熱休克蛋白70(HSP70)、環(huán)氧化酶2(COX-2)、活化的凋亡蛋白3(Actived-Caspase3)表達(dá)的情況。治療2周后每組取3只小鼠,通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法,比較CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和表達(dá)細(xì)胞毒性標(biāo)志顆粒酶B陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)水平。以比較各組氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞免疫效應(yīng)強(qiáng)度的差異。4.建立BALB/c小鼠腹股溝皮下4T1乳腺癌模型,取瘤體合格小鼠分為3組(PDT+GC組、PDT組、Control組),分別接受相應(yīng)的治療。治療1周后,每組處死小鼠3只,無(wú)菌取出肺臟,通過(guò)機(jī)械和酶消化的方法制備肺組織的單細(xì)胞懸液,加到含有6-巰鳥(niǎo)嘌呤的培養(yǎng)基中,利用4T1細(xì)胞對(duì)6-巰鳥(niǎo)嘌呤的選擇性耐藥特性進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn),14天后比較各組克隆形成情況。治療3周后,處死各組小鼠3只,稱量小鼠體重,取出肺臟,使用Bouin's溶液固定肺臟組織24小時(shí)后,計(jì)數(shù)肺臟表面白色瘤結(jié)節(jié)的個(gè)數(shù)并進(jìn)行組間比較,通過(guò)HE染色驗(yàn)證轉(zhuǎn)移瘤的形成。取出小鼠脾臟,測(cè)量脾臟重量,計(jì)算各小鼠的脾系數(shù)(脾臟重量÷小鼠自身體重)。研究結(jié)果1.倒置熒光顯微鏡下觀察8μg/ml Photofrin與EMT6細(xì)胞孵育時(shí)間小于8h時(shí),可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出微弱的紅色熒光,細(xì)胞輪廓不清晰。8h-24h細(xì)胞輪廓較清楚,12h熒光最強(qiáng),細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變且繼續(xù)增殖,說(shuō)明8μg/ml Photofrin在24小時(shí)內(nèi)細(xì)胞暗毒性低。多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值,發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)細(xì)胞內(nèi)光敏劑含量隨著光敏劑的濃度升高及孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。2.在功率密度12.5mW/cm2、能量密度7.5J/cm2照射條件下,在一定范圍內(nèi),隨著光敏劑的濃度及孵育時(shí)間的延長(zhǎng),光動(dòng)力治療體外殺傷效應(yīng)增強(qiáng)。8ug/ml Photofrin孵育6h抑制率可達(dá)到50%。在8μg/ml Photofrin孵育6h后、能量密度為7.5J/cm2照射條件下,功率密度在一定范圍內(nèi)對(duì)光動(dòng)力治療體外殺傷效應(yīng)無(wú)明顯影響(P=0.076),相同功率密度的單純激光對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性(P0.05)。在8μg/ml Photofrin孵育6h后、功率密度均為12.5mW/cm2照射條件下,在一定能量密度范圍內(nèi),PDT殺傷效應(yīng)隨能量密度上升而增強(qiáng)(P0.01),相同能量密度的單純激光對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性(P0.05)。3.小鼠臀部皮下EMT6乳腺癌模型成瘤率100%,6組治療前腫瘤體積無(wú)差異(P=0.594),治療后觀察PDT+GC組發(fā)現(xiàn)瘤體依次出現(xiàn)水腫、發(fā)黑、焦痂形成、焦痂脫落,瘤體縮小后輕微增大或消失。PDT組腫瘤在治療后體積明顯縮小,在第9天左右治療焦痂掉落后可見(jiàn)殘余腫瘤組織,之后又逐漸增大。PDT+GC組在治療后第1天由于腫脹明顯,腫瘤體積有所增大,但之后隨著水腫的減輕,至治療后第9天左右體積與PDT組相當(dāng),之后腫瘤生長(zhǎng)緩慢,部分仍有縮小趨勢(shì)。重復(fù)測(cè)量的方差分析顯示PDT+GC組與PDT組腫瘤體積未見(jiàn)明顯差異(P=0.282)。各組的生存分析顯示PDT+GC組、PDT組、Laser+GC組小鼠的中位生存時(shí)間比Contro1組長(zhǎng)(P值分別是0.000、0.001、0.003),且PDT+GC組與PDT組或Laser+GC組相比存在生存優(yōu)勢(shì)(P值分別為0.036、0.000)。治愈小鼠在再次接種相同數(shù)目的腫瘤細(xì)胞后,皮下腫塊出現(xiàn)時(shí)間晚、腫瘤生長(zhǎng)較同齡對(duì)照小鼠緩慢,且PDT+GC組兩只小鼠腫瘤分別于接種后27d和35d完全消失。4.瘤組織HE染色見(jiàn)PDT+GC;組、PDT組出現(xiàn)明顯的壞死帶,血管內(nèi)紅細(xì)胞淤積、血栓形成,且壞死灶周圍有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),Laser+GC組、Laser組、GC組壞死較輕微。在治療后的兩周,PDT+GC組、PDT組和Laser+GC組的腫瘤組織內(nèi)CD3+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和表達(dá)細(xì)胞毒性標(biāo)志顆粒酶B陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目比均較對(duì)照組高(P0.001),但是這3種標(biāo)志的浸潤(rùn)數(shù)目比在GC組和對(duì)照組沒(méi)有區(qū)別(P值分別是0.978、0.424、0.430)。Laser組CD8+T細(xì)胞和表達(dá)細(xì)胞毒性標(biāo)志顆粒酶B陽(yáng)性淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目比較對(duì)照組高(P值分別是0.001、0.025),但CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)比在兩組之間無(wú)差異(P=1.000)。雖然PDT+GC組與PDT組相比CD3+T細(xì)胞的浸潤(rùn)比無(wú)差異(P=0.712),但是免疫細(xì)胞具有殺傷活性的標(biāo)志CD8和Granzyme B在PDT+GC組表達(dá)數(shù)目比較PDT組高(P值分別是0.030,0.022)。在治療后48小時(shí)用免疫組化的方法檢測(cè)各組腫瘤組織iNOS、HSP70、COX-2和Actived-Caspase3的表達(dá)情況,結(jié)果顯示PDT+GC組、PDT組、Laser+GC腫瘤組織中iNOS、HSP70、COX-2和Actived-Caspase3的表達(dá)水平均較對(duì)照組高(P0.001)。雖然PDT+GC組和PDT組腫瘤組織COX-2的表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P=0.078),但PDT+GC組氧化反應(yīng)標(biāo)志iNOS、應(yīng)激水平標(biāo)志HSP70、細(xì)胞凋亡標(biāo)志Actived-Caspase3的表達(dá)水平均較PDT組高(P值分別是0.038、0.039、0.040)。PDT+GC組4種蛋白的表達(dá)水平均較Laser+GC組高(P值分別是0.000、0.021、0.040、0.021)。這4種蛋白水平在GC組與對(duì)照組中無(wú)明顯差異。5.免疫印跡的結(jié)果顯示PDT+GC組與對(duì)照組相比Caspase-3表達(dá)下降,Actived-caspase-3、COX-2、HSP70表達(dá)升高。PDT+GC組與PDT組相比Actived-caspase-3表達(dá)較高,Caspase-3表達(dá)較低。6.小鼠腹股溝皮下4T1乳腺癌模型成瘤率100%,分組(PDT+GC組、PDT組、Control組)治療1周后,藥物篩選肺組織腫瘤細(xì)胞的平板克隆實(shí)驗(yàn)示PDT+GC治療、PDT治療后肺臟轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量顯著小于Control組(P值分別是0.002、0.042),且PDT+GC組少于PDT組(P=0.035)；治療后3周肺臟大體標(biāo)本觀察示PDT+GC組、PDT組肺臟表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量顯著小于Control組(P值分別是0.001、0.017),且PDT+GC組少于PDT組(P=0.028)；HE染色驗(yàn)證肺臟轉(zhuǎn)移瘤的形成；PDT+GC組與PDT組脾系數(shù)均大于Control組(P值分別是0.001、0.029),且PDT+GC組脾系數(shù)大于PDT組(P=0.031)。研究結(jié)論1.本研究客觀觀察了光敏劑的吸收過(guò)程。發(fā)現(xiàn)細(xì)胞吸收一定濃度的光敏劑和接受適當(dāng)劑量的光照是光動(dòng)力治療體外殺傷效應(yīng)的兩個(gè)必備條件,找到更理想的光照劑量、光敏劑濃度、給藥-治療間隔時(shí)間是提高PDT療效的關(guān)鍵。2.LIT治療能夠顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng),延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的生存時(shí)間,并且產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫。LIT治療與單純的PDT治療相比能夠增加局部NO產(chǎn)量、增加局部腫瘤細(xì)胞HSP70表達(dá),增強(qiáng)局部炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、趨化更多的免疫活性細(xì)胞至腫瘤局部。3.GC能夠增強(qiáng)PDT治療的系統(tǒng)抗腫瘤效應(yīng),并證實(shí)這種系統(tǒng)抗腫瘤效應(yīng)存在機(jī)體免疫系統(tǒng)的參與。4.4T1轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型是一種比較理想的激光免疫治療模型。利用4T1細(xì)胞對(duì)6-巰鳥(niǎo)嘌呤選擇性耐藥特性,我們可以更加直觀地觀察到LIT治療的系統(tǒng)效應(yīng),早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：光動(dòng)力治療 激光免疫治療 惡性腫瘤 糖基化聚氨基葡糖 4T1轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型 免疫效應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-20
• 第一章 前言20-29
• 1.1 光動(dòng)力治療的基本原理、作用機(jī)制和優(yōu)缺點(diǎn)21-23
• 1.2 激光免疫治療的概念及意義23-25
• 1.3 相關(guān)蛋白與惡性腫瘤的關(guān)系25-28
• 1.4 小鼠4T1轉(zhuǎn)移性乳腺癌模型的特點(diǎn)28-29
• 第二章 Photofrin-PDT對(duì)EMT6體外抑制效應(yīng)研究29-40
• 2.1 材料與儀器29-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法30-34
• 2.3 結(jié)果34-38
• 2.4 討論38-39
• 2.5 結(jié)論39-40
• 第三章 GC聯(lián)合光動(dòng)力治療增強(qiáng)特異性抗腫瘤免疫的初步探討40-72
• 3.1 材料與試劑40-42
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法42-52
• 3.3 結(jié)果52-68
• 3.4 討論68-71
• 3.5 結(jié)論71-72
• 全文小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-79
• 中英文對(duì)照縮略詞表79-81
• 攻讀學(xué)位期間成果81-82
• 致謝82-83

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 趙洪友;通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體形態(tài)提高光動(dòng)力治療腫瘤效果的基礎(chǔ)研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2014年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 文永兵;金絲桃素對(duì)實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的光動(dòng)力效應(yīng)的研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：770835