本文關(guān)鍵詞：MPPa-PDT誘導(dǎo)的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡和自噬

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【摘要】：目的:Pyropheophorbide-αmethyl ester(MPPa)屬于第二代光敏劑,具有很好的應(yīng)用前景。本研究以體外培養(yǎng)的人骨肉瘤MG-63細(xì)胞為研究對象,采用MPPa介導(dǎo)的光動力療法(MPPa-PDT)處理人骨肉瘤MG-63細(xì)胞,檢測MPPa-PDT能否誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬反應(yīng)并在信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白表達(dá)水平探索其可能的分子機(jī)制,最后進(jìn)一步探索MPPa-PDT作用下MG-63細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。為MPPa-PDT用于骨肉瘤的臨床治療以及調(diào)節(jié)自噬和凋亡水平以增強MPPa-PDT的抗腫瘤效應(yīng)奠定實驗理論基礎(chǔ)。方法:MPPa-PDT作用于體外培養(yǎng)的人骨肉瘤MG63細(xì)胞,采用CCK-8檢測細(xì)胞活性的變化,以明確MPPa-PDT對MG-63細(xì)胞的毒性效應(yīng),并選擇后續(xù)實驗所采用的MPPa藥物劑量和LED光照能量密度。然后應(yīng)用Hoechst熒光染色觀察細(xì)胞凋亡,Annexin V-PI染色后應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測MG-63細(xì)胞凋亡水平的變化,應(yīng)用Western blot檢測MG-63細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,探明MPPa-PDT能否誘導(dǎo)mg-63細(xì)胞發(fā)生凋亡。應(yīng)用jc-1染色熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位(mtΔψ)的變化,應(yīng)用westernblot檢測線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,明確線粒體凋亡途徑是否參與mppa-pdt誘導(dǎo)的mg-63細(xì)胞凋亡。應(yīng)用mdc染色觀察細(xì)胞的自噬小體,應(yīng)用透射電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),進(jìn)一步采用westernblot檢測自噬標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平的變化,明確mppa-pdt能否誘導(dǎo)mg-63細(xì)胞發(fā)生自噬。應(yīng)用dcfh-da染色熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ros)水平,westernblot檢測jnk磷酸化水平的變化,明確mppa-pdt能否激活mg-63細(xì)胞內(nèi)的ros-jnk通路;采用ros清除劑(nac)和jnk抑制劑(sp600125)分別清除細(xì)胞內(nèi)ros和抑制jnk的激活,通過westernblot檢測jnk的磷酸化水平、自噬標(biāo)志性蛋白的表達(dá)水平,明確ros-jnk通路是否參與mppa-pdt誘導(dǎo)的mg-63細(xì)胞自噬。最后采用自噬抑制劑(3-ma和cq)抑制細(xì)胞自噬水平,annexinv-pi染色后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡水平的變化,采用westernblot檢測凋亡相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平的變化,明確mppa-pdt作用下mg-63細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。結(jié)果:mppa-pdt能明顯抑制人骨肉瘤mg63細(xì)胞的活性,且其抑制作用呈mppa濃度-光照能量密度劑量依賴性。mppa-pdt能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并伴隨有線粒體凋亡途徑的激活,主要表現(xiàn)為mppa-pdt處理后細(xì)胞凋亡率明顯升高,凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平升高,同時線粒體膜電位降低,線粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)升高。mppa-pdt能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,并且ROS-JNK通路參與了MPPa-PDT誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞自噬,表現(xiàn)為MPPa-PDT處理后細(xì)胞MDC染色熒光明顯增強,MDC陽性的斑點樣結(jié)構(gòu)明顯增多,電鏡可觀察到典型的自噬小體結(jié)構(gòu),自噬標(biāo)志性蛋白表達(dá)水平明顯升高;ROS清除劑(NAC)和Jnk抑制劑(SP600125)都能抑制MPPa-PDT所誘導(dǎo)的自噬,且ROS清除劑能抑制Jnk的磷酸化。MPPa-PDT誘導(dǎo)的自噬可促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡的發(fā)生,表現(xiàn)為自噬抑制劑(3-MA和CQ)預(yù)處理可明顯降低細(xì)胞的凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論:線粒體途徑參與MPPa-PDT誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞凋亡,ROS-Jnk信號通路參與MPPa-PDT誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞自噬;并且MPPa-PDT誘導(dǎo)的自噬促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：骨肉瘤 光動力療法 MPPa 自噬 凋亡
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-10
• 前言10-12
• 1 材料與方法12-19
• 2 結(jié)果19-22
• 3 討論22-25
• 4 結(jié)論25-26
• 參考文獻(xiàn)26-31
• 附插圖31-38
• 文獻(xiàn)綜述38-47
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 致謝47-48
• 攻讀碩士期間的科研情況簡介48-49

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃秋;涂平華;歐云生;劉渤;陶勇;尹航;;MPPa-PDT誘導(dǎo)人骨巨細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2015年17期

2 ;JNK pathway:diseases and therapeutic potential[J];Acta Pharmacologica Sinica;2007年05期

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本文編號：769620