本文關(guān)鍵詞：不同轉(zhuǎn)移潛能的膀胱細(xì)胞株的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的N-連接聚糖分布解析

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【摘要】：膀胱細(xì)胞癌是一種常見的惡性腫瘤,它的發(fā)生與糖鏈的異常表達(dá)關(guān)系緊密。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的提取有利于低豐度蛋白的提取,降低研究細(xì)胞蛋白組學(xué)的復(fù)雜度。亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)糖組學(xué)的研究有助于了解亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能多樣性的機(jī)理。本研究以一株肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系(YTS1),一株非肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞系(KK47)和一株正常膀胱上皮細(xì)胞系(HCV29)為實(shí)驗(yàn)材料,使用改進(jìn)的差速離心的方法獲得了四類亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(微粒體、線粒體、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))的蛋白質(zhì)組分及其糖蛋白質(zhì)糖鏈結(jié)構(gòu),利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)結(jié)合凝集素芯片的方法鑒定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的糖基化修飾類型和結(jié)構(gòu)。1.通過改進(jìn)的差速離心法可以高效提取YTS1、KK47、HCV29細(xì)胞的四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白,該結(jié)果通過SDS-PAGE,銀染和Western blot技術(shù)得到驗(yàn)證。2. 比較了N-連接聚糖在四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的含量差異。凝集素芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在YTS1的四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中與凝集素LCA、AAL、MPL、WGA和PWM結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu),在KK47的四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中與凝集素STL、VVA、LCA、LTL、EEL和WGA結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu),在HCV29的四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中與凝集素ConA、GNA、VVA 和 ACA結(jié)合的糖鏈結(jié)構(gòu)在不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中差異顯著。在YTS1中,凝集素LCA識(shí)別的N-連接聚糖含量在線粒體和細(xì)胞核的差異顯著,凝集素AAL識(shí)別的N-連接聚糖含量在線粒體和細(xì)胞質(zhì)差異顯著,凝集素MPL識(shí)別的N-連接聚糖含量在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中差異顯著。在KK47中,凝集素STL識(shí)別的N-連接聚糖含量在線粒體和細(xì)胞核中差異顯著,凝集素AAL識(shí)別的N-連接聚糖含量在微粒體和細(xì)胞質(zhì)中差異顯著。在HCV29中,凝集素GNA識(shí)別的N-連接聚糖含量在微粒體和細(xì)胞核中差異顯著。3. 比較了N-連接聚糖的不同糖型在四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布。質(zhì)譜結(jié)果顯示總共有40種、32種、15種N-連接聚糖在YTS1、KK47、HCV29兩種細(xì)胞中被檢測到。在YTS1、KK47、HCV29的四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中高甘露糖型和巖藻糖化型是N-連接聚糖的主要糖型。YTS1、KK47、HCV29分別有10種、5種、7種N-連接聚糖出現(xiàn)在四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,分別有10種、17種、3種N-連接聚糖僅出現(xiàn)在一種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中,這些糖鏈結(jié)構(gòu)可能作為特定細(xì)胞器的聚糖標(biāo)志物。4. 建立并優(yōu)化濾膜輔助的化學(xué)方法提取N-連接聚糖,并且在標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品、血清水平和細(xì)胞水平得到驗(yàn)證。本研究率先在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平上建立糖組學(xué)的研究方法,為闡釋糖蛋白功能的多樣性提供了理論依據(jù)。凝集素芯片技術(shù)結(jié)合質(zhì)譜方法研究人膀胱非肌層浸潤性膀胱癌細(xì)胞株KK47、人膀胱肌層浸潤性癌細(xì)胞株YTS1、正常的人膀胱上皮細(xì)胞株HCV29的四種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)聚糖的分布具有高分辨率和高靈敏性,有利于不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的聚糖和相應(yīng)的糖基化蛋白功能的研究。
【關(guān)鍵詞】：亞細(xì)胞結(jié)構(gòu) N-連接聚糖 凝集素芯片 MALDI-TOF/TOF-MS
【學(xué)位授予單位】：福建農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.14
【目錄】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1.前言11-16
• 1.1 膀胱細(xì)胞癌11
• 1.2 糖組學(xué)11-13
• 1.2.1 細(xì)胞蛋白質(zhì)糖基化和主要類型11-12
• 1.2.2 N-連接聚糖的釋放12
• 1.2.3 糖鏈的解析技術(shù)12-13
• 1.3 質(zhì)譜技術(shù)在糖鏈分析中的應(yīng)用13-14
• 1.3.1 質(zhì)譜技術(shù)的原理13
• 1.3.2 應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)分析糖鏈結(jié)構(gòu)13-14
• 1.4 凝集素芯片技術(shù)在糖組學(xué)中的應(yīng)用14-15
• 1.4.1 凝集素芯片的原理14
• 1.4.2 應(yīng)用凝集素芯片方法分析糖鏈結(jié)構(gòu)14-15
• 1.5 亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)研究15-16
• 1.6 研究目的和意義16
• 2. 材料與方法16-22
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-17
• 2.1.1 材料16
• 2.1.2 試劑16-17
• 2.1.3 儀器17
• 2.1.4 分析軟件17
• 2.2 方法17-22
• 2.2.1 膀胱癌細(xì)胞培養(yǎng)17-18
• 2.2.2 細(xì)胞破碎以及總蛋白的提取18
• 2.2.3 亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的提取和驗(yàn)證18-19
• 2.2.4 蛋白樣品中糖鏈的釋放19-20
• 2.2.5 初級(jí)N-糖糖鏈樣品除鹽20
• 2.2.6 N-糖糖鏈樣品的MALDI-TOF-質(zhì)譜解析20-21
• 2.2.7 凝集素芯片分析21-22
• 3. 結(jié)果與分析22-41
• 3.1 細(xì)胞器marker確定亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白分離效果22-23
• 3.2 基于凝集素芯片法YTS1、KK47、HCV29亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)糖蛋白的糖型分析23-29
• 3.3 YTS1、KK47、HCV29亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的N-連接聚糖的質(zhì)譜分析29-33
• 3.4 YTS1、KK47、HCV29亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)糖蛋白N-連接聚糖的糖型的相對比例差異33-36
• 3.5 糖鏈結(jié)構(gòu)的確定和二級(jí)質(zhì)譜圖36-38
• 3.6 濾膜輔助的化學(xué)方法提取糖鏈38-41
• 4. 討論與結(jié)論41-43
• 參考文獻(xiàn)43-47
• 附錄47-49
• 致謝49

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 黃魯瑜;不同轉(zhuǎn)移潛能的膀胱細(xì)胞株的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的N-連接聚糖分布解析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：759721