本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒介導(dǎo)的hTERT C197片段抗腫瘤活性及分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 重組腺病毒NF-κB信號(hào)通路 細(xì)胞增殖 端粒酶活性

【摘要】：研究背景與目的端粒(telomere,TE)是存在于染色體末端保護(hù)染色體的帽狀結(jié)構(gòu),在維持基因組的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性上起到關(guān)鍵性作用。在正常人體細(xì)胞中,端粒是是隨著細(xì)胞分裂而縮短,當(dāng)縮短到一定程度時(shí),染色體DNA將變得不再穩(wěn)定,細(xì)胞開始出現(xiàn)衰老或死亡。人端粒酶(telomerase, TM)是由人端粒酶RNA組分(hTR),人端粒酶相關(guān)蛋白(hTRP)和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)三部分組成的蛋白質(zhì)復(fù)合物。它能以自身RNA為模板通過逆轉(zhuǎn)錄方式,不斷合成新的端粒重復(fù)序列并連接端粒,防止端粒縮短從而使得細(xì)胞出現(xiàn)永生化。有研究報(bào)道指出端粒酶活性在大部分腫瘤組織中被檢測(cè)到,這表明端粒酶的激活可能是腫瘤發(fā)生,發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此,端粒酶是識(shí)別腫瘤細(xì)胞存在的重要標(biāo)志。最近研究發(fā)現(xiàn),端粒酶也可發(fā)揮端粒外的作用,可通過調(diào)節(jié)NF-κB通路和Wnt/β-Catenin通路等作用,促進(jìn)腫瘤的形成,這些端粒外作用與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系,端粒酶被視為一個(gè)抗腫瘤的潛在靶點(diǎn)。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是人端粒酶的重要組成部分。由于hTERT mRNA的表達(dá)與端粒酶活性密切相關(guān)并一致,所以通常認(rèn)為hTERT是端粒合成的限速酶,對(duì)維持腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到非常重要的作用。細(xì)胞hTERT活性被抑制會(huì)使端粒酶活性降低,促進(jìn)細(xì)胞中端粒逐漸縮短。hTERT蛋白包括胞漿和核仁之間的穿梭運(yùn)輸?shù)鞍?有研究表明,hTERT直接與NF-κB靶基因啟動(dòng)子DNA結(jié)合并與P65亞基作用后可啟動(dòng)有關(guān)癌基因表達(dá),同時(shí)也闡明了hTERT通過調(diào)節(jié)NF-κB通路可促腫瘤作用的重要機(jī)制。hTERT結(jié)構(gòu)包括N端、逆轉(zhuǎn)錄區(qū)和C端,盡管C端保守性較低,但研究中證實(shí)hTERT C端具有調(diào)節(jié)端粒酶核轉(zhuǎn)位功能。C端對(duì)人端粒酶活性很重要,hTERT通過相關(guān)蛋白與端粒DNA結(jié)合后,使端粒引物末端正好位于端粒酶RNA(TR)模板區(qū)起始端位置,這個(gè)步驟是使端粒不斷延伸的關(guān)鍵所在。有研究報(bào)道,有人設(shè)計(jì)只含有hTERT C端和部分逆轉(zhuǎn)錄區(qū)片段,因分子量為27 kDa,故命名為hTERT C27。該片段在Hela細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡,增加5-FU的抗腫瘤活性,其機(jī)制目前還不清楚�，F(xiàn)有的研究表明,C27不抑制端粒酶活性,其抗腫瘤活性與引起染色體端-端融合,并可能與細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期、免疫反應(yīng)等有關(guān)。本課題前期在hTERT C端截取編碼第936-1132氨基酸的堿基序列片段,構(gòu)建了真核和原核表達(dá)載體。該基因序列包括一個(gè)核仁定位信號(hào)序列(第965-981氨基酸)和與五個(gè)端粒DNA結(jié)合的氨基酸序列(第963-972、993-1002、1047-1056、1077-1086、1108-1117氨基酸)。由于表達(dá)的hTERT C末端包含197個(gè)氨基酸,我們把它命名為C197。前期的研究表明,C197能夠抑制Hela細(xì)胞增殖。但表達(dá)量不高,不便于后續(xù)研究。為了便于體內(nèi)試驗(yàn)和增強(qiáng)表達(dá)效果,本研究利用過表達(dá)載體重組腺病毒PAdEasy-1載體系統(tǒng),構(gòu)建了能高效表達(dá)C197片段的重組腺病毒Ad-GFP-C197,通過觀察C197過表達(dá)在體內(nèi)外對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,為進(jìn)一步研究hTERT的C末端功能打下基礎(chǔ),同時(shí)也為腫瘤的生物治療提供新的思路。方法1.重組腺病毒Ad-GFP-C197構(gòu)建與表達(dá)1.1 C197基因片段的獲取根據(jù)GenBank公布的人hTERT基因序列,選取C端第936-1132氨基序列片段(命名為C197),在該片段中的C端引入Ecor V限制性酶切位點(diǎn),在N端引入6個(gè)his標(biāo)簽和Sal Ⅰ限制性酶切位點(diǎn),片段總長(zhǎng)度為650 bp,將其合成后克隆至pGSI載體保存。使用時(shí)經(jīng)雙酶切后經(jīng)過回收純化得到外源基因片段C197即可。1.2重組腺病毒Ad-GFP-C197的構(gòu)建將帶有6個(gè)his標(biāo)簽C197的cDNA序列克隆至穿梭質(zhì)粒PAdTrack-CMV得到重組質(zhì)粒PAdTrack-CMV-C197,經(jīng)Pme I酶切線性化后轉(zhuǎn)化進(jìn)入到含有骨架質(zhì)粒PAdEasy-1的BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組,得到重組大質(zhì)粒PAd-GFP-C197并進(jìn)行一系列鑒定,確定構(gòu)建成功后,將其轉(zhuǎn)染進(jìn)入HEK293細(xì)胞中進(jìn)行包裝,得到重組腺病毒Ad-GFP-C197。對(duì)照腺病毒Ad-GFP按照同樣的方法進(jìn)行構(gòu)建。1.3 目的蛋白C197的表達(dá)把重組腺病毒Ad-GFP-C197感染新的一批HEK293細(xì)胞,提取細(xì)胞RNA和細(xì)胞總蛋白后,用熒光定量PCR方法檢測(cè)C197 mRNA的轉(zhuǎn)錄情況,用免疫印跡法檢測(cè)鑒定目的蛋白C197表達(dá)情況。1.4重組腺病毒滴度測(cè)定HEK293細(xì)胞鋪于24孔板中,每孔5×105細(xì)胞。重組腺病毒用PBS稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10- 76個(gè)梯度。待細(xì)胞貼壁后,將稀釋好的病毒每孔加入50 ul,每組實(shí)驗(yàn)共3個(gè)復(fù)孔。48 h觀察并計(jì)算綠色熒光數(shù)。熒光數(shù)在20-50個(gè)最佳。按照公式：病毒滴度PFU/ml=[(一個(gè)視野的熒光數(shù))*每個(gè)孔的視野數(shù)]/(加入的病毒體積*稀釋倍數(shù))計(jì)算病毒滴度即可。1.5 C197蛋白的表達(dá)與純化按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)Hela細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按照1×106鋪板于100 mm2培養(yǎng)皿中(共15個(gè)皿),待細(xì)胞密度為80%時(shí),進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)(用重組腺病毒Ad-GFP-C197用冷的無菌PBS稀釋后,以MOI=100感染各培養(yǎng)皿中Hela細(xì)胞)；待24 h后換液并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光,于48 h收集細(xì)胞并提取總蛋白,利用金屬(Ni2+)柱(鎳柱)將帶有his標(biāo)簽的C197蛋白掛住,用梯度咪唑溶液進(jìn)行洗脫,回收洗脫液行SDS-PAGE后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察25 KDa附近是否有條帶即可。1.6重組腺病毒Ad-GFP-C197對(duì)Hela細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)Hela田胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按1×104個(gè)接種到96孔培養(yǎng)板中,Hela細(xì)胞接7塊96孔板,共2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(n=6),待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)后每隔24h取出一塊96孔培養(yǎng)板,MTT法測(cè)量所有實(shí)驗(yàn)孔OD值,對(duì)照病毒組和重組腺病毒組各有6個(gè)單獨(dú)樣本并對(duì)其OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將Hela細(xì)胞按1×105個(gè)接種到24孔培養(yǎng)板中。接3塊24孔板,共2個(gè)實(shí)驗(yàn)組(Ad-GFP-C197組和Ad-GFP組,n=3),待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)干預(yù)后分別于24 h、48 h和72 h取出24孔培養(yǎng)板,按照Annexin V-PE凋亡試劑盒說明書處理樣品后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)并收集數(shù)據(jù),根據(jù)早期凋亡細(xì)胞占活細(xì)胞數(shù)的比例來計(jì)算凋亡率并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；以上均數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,使用單因素方差分析的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,分析其是否具有顯著性差異。2重組腺病毒Ad-GFP-C197的細(xì)胞內(nèi)定位及對(duì)Hela細(xì)胞中端粒酶活性的影響按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按1×105個(gè)接種到10 mm2共聚焦小皿中,待細(xì)胞貼壁后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)；分別于24 h和48 h用4%多聚甲醛固定后通過TRITC-二抗免疫熒光染色,細(xì)胞核用DAPI染色后,在免疫共聚焦顯微鏡下觀察C197蛋白位移情況。同時(shí)將Hela細(xì)胞按2×105個(gè)接種6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。收集Ad-GFP-C197感染24 h、48 h和72 h后的Hela細(xì)胞,對(duì)照病毒Ad-GFP感染72 h的Hela細(xì)胞以及正常的Hela細(xì)胞。分別提取總蛋白并調(diào)成一致濃度,按照TRAPEZE(?) Telomerase Detection Kit說明書操作；產(chǎn)物行12.5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后用EB溶液染色30min,純水泡30min后于凝膠成像系統(tǒng)下拍照。3 hTERT蛋白和NF-κB通路相關(guān)因子表達(dá)的檢測(cè)按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。將Hela細(xì)胞按2×105個(gè)／孔接種到6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。提取各組細(xì)胞蛋白后,用免疫印跡法檢測(cè)hTERT蛋白、P65蛋白和IκBα蛋白表達(dá)情況。4 重組腺病毒Ad-GFP-C197體內(nèi)對(duì)腫瘤的作用按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇、傳代等操作。取周齡為4-6周的雄性裸鼠在12 h日夜交替光照的條件下培養(yǎng),收集好Hela細(xì)胞后與Matrigel調(diào)整細(xì)胞密度為5×107個(gè)/mL,每只裸鼠的右下肢皮下接種0.2 ml Hela細(xì)胞。待腫瘤直徑達(dá)到4-6 mm時(shí),隨機(jī)分為兩組并進(jìn)行瘤內(nèi)給藥Ad-GFP-C197和Ad-GFP。一周兩次,每隔1周測(cè)量一次體積,共給藥5周。根據(jù)每周體積繪制各組腫瘤生長(zhǎng)曲線并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。最后一周將各組腫瘤組織取出并拍照,對(duì)其稱重后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；4%多聚甲醛固定后用Tunel法檢測(cè)各組腫瘤組織的凋亡情況；并用免疫組化法檢測(cè)各組腫瘤組織中P65、IκVα蛋白表達(dá)情況。另取一部分組織提取總蛋白行免疫印跡測(cè)定C197表達(dá)情況。結(jié)果與結(jié)論1.成功構(gòu)建了重組腺病毒Ad-GFP-C197,且C197能夠在細(xì)胞中得到高效表達(dá)。2.依照單因素方差分析結(jié)果顯示,重組腺病毒Ad-GFP-C197對(duì)Hela細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用,并明顯抑制細(xì)胞增殖,在感染后第六天增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率最大(分別為49.49%和38.07%)。3.在重組腺病毒Ad-GFP-C197感染后的Hela細(xì)胞中觀察到C197蛋白能夠從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入到細(xì)胞核,也驗(yàn)證了hTERT C端含有核仁定位信號(hào)。4.C197蛋白純化結(jié)果顯示出三條蛋白條帶,且在分子量大小為25 KDa附近出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶,進(jìn)一步驗(yàn)證了C197蛋白表達(dá)后的確表達(dá)了且大小約為25KDa,同時(shí)為C197蛋白純化提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。5.重組腺病毒Ad-GFP-C197能夠抑制Hela細(xì)胞中端粒酶活性,并且能夠下調(diào)hTERT蛋白的表達(dá)。6.重組腺病毒Ad-GFP-C197明顯抑制Hela細(xì)胞中IκBα、P65蛋白的表達(dá)水平；提示Ad-GFP-C197的抗腫瘤作用與影響NF-κB通路的活性有關(guān)。7.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在腫瘤組織中注射重組腺病毒Ad-GFP-C197,腫瘤組織能表達(dá)C197,且Ad-GFP-C197能明顯抑制腫瘤組織的生長(zhǎng),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,下調(diào)腫瘤組織中IκBα、P65蛋白的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶 重組腺病毒NF-κB信號(hào)通路 細(xì)胞增殖 端粒酶活性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R73-36
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-25
• 第一章 重組腺病毒Ad-GFP-C197的構(gòu)建與表達(dá)25-42
• 1、實(shí)驗(yàn)材料25-28
• 1.1 主要設(shè)備與儀器25
• 1.2 材料與試劑25-27
• 1.3 主要試劑的配制27-28
• 2、實(shí)驗(yàn)流程28-29
• 3、實(shí)驗(yàn)方法29-36
• 3.1 C197 cDNA的獲取29
• 3.2 重組腺病毒大質(zhì)粒PAd-GFP-C197的構(gòu)建及鑒定29-32
• 3.3 重組腺病毒Ad-GFP-C197的包裝32-33
• 3.4 重組腺病毒Ad-GFP-C197的鑒定33-35
• 3.5 重組腺病毒的純化及滴度測(cè)定35
• 3.6 C197蛋白的純化35-36
• 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-41
• 4.1 雙酶切獲得目的片段36-37
• 4.2 重組腺病毒大質(zhì)粒PAd-GFP-C197的構(gòu)建及鑒定37-39
• 4.3 重組腺病毒Ad-GFP-C197的鑒定39-40
• 4.4 重組腺病毒Ad-GFP-C197的滴度測(cè)定40
• 4.5 C197蛋白純化結(jié)果40-41
• 5、實(shí)驗(yàn)結(jié)論41-42
• 第二章 重組腺病毒Ad-GFP-C197對(duì)Hela細(xì)胞影響及其機(jī)制研究42-57
• 1、實(shí)驗(yàn)材料42-44
• 1.1 主要儀器與設(shè)備42
• 1.2 材料與試劑42-43
• 1.3 主要工作液的配制43-44
• 2、實(shí)驗(yàn)方法44-49
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)44-45
• 2.2 重組腺病毒Ad-GFP-C197對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響45-46
• 2.3 重組腺病毒Ad-GFP-C197對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響46-47
• 2.4 重組腺病毒Ad-GFP-C197體外抑瘤機(jī)制研究47-49
• 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-56
• 3.1 重組腺病毒Ad-GFP-C197抑制Hela細(xì)胞增殖49-53
• 3.2 重組腺病毒Ad-GFP-C197誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡53-54
• 3.3 Ad-GFP-C197體外作用的分子機(jī)制研究54-56
• 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論56-57
• 第三章 重組腺病毒Ad-GFP-C197體內(nèi)抑瘤作用及其機(jī)制研究57-68
• 1、實(shí)驗(yàn)材料57-59
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物57
• 1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑57-58
• 1.3 主要儀器58
• 1.4 主要工作液配制58-59
• 2 實(shí)驗(yàn)方法59-63
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)59-60
• 2.2 裸鼠實(shí)體瘤(Hela)的制備方法60-61
• 2.3 腫瘤組織細(xì)胞凋亡、目的蛋白及靶蛋白表達(dá)檢測(cè)61-63
• 3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-67
• 3.1 重組腺病毒Ad-GFP-C197抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)63-65
• 3.2 C197蛋白在腫瘤組織中表達(dá)65
• 3.3 重組腺病毒Ad-GFP-C197促進(jìn)腫瘤組織的凋亡65-66
• 3.4 腫瘤組織中P65和IκBα蛋白表達(dá)下調(diào)66-67
• 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論67-68
• 討論68-73
• 結(jié)論73-74
• 參考文獻(xiàn)74-80
• 中英文略縮詞表80-82
• 碩士期間發(fā)表論文82-83
• 致謝83-84

【共引文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 鄔賢;陳嘉盛;曹瑩;丘玉昌;龐建新;;重組腺病毒Ad-GFP-C197的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究[J];生命科學(xué)研究;2015年03期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 吳小琴;新型手性二氫吡唑類化合物靶向hTERT抑制胃癌細(xì)胞MGC-803增殖的作用機(jī)制研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：759535