本文關(guān)鍵詞：靶向舌鱗癌細(xì)胞高分子超聲造影劑的制備及體外尋靶實驗

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【摘要】：舌鱗狀細(xì)胞癌(Tongue squamous cell carcinoma, TSCC)患者早期易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,明顯影響其預(yù)后,并決定腫瘤分期及治療方案。于是及時診斷及治療舌癌患者頸部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)成為提高生存率的迫切需求�；谂R床上尚無一種可靠客觀的無創(chuàng)性檢查和治療手段。第4代聲學(xué)造影劑由于具備有靶向診斷和靶向給藥的功能成為診療舌癌原發(fā)灶及其頸部淋巴道轉(zhuǎn)移灶的探索方向。其中,高分子聚合物作為第4代超聲造影劑(Ultrasound contrast agent, UC A)外殼材料之一,聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(Lactic-co-glycolic acid), PLGA]具備優(yōu)異的生物相容性、可控生物降解性、良好的成球或成膜性能以及增加藥物和DNA投遞和定位的功效優(yōu)勢。TATp(transactivating transcriptional activator protein from human immunodeficiency virus type 1, HIV-1 TAT)人類免疫缺陷病毒的反式轉(zhuǎn)錄活化因子作為細(xì)胞穿膜肽之一,能將載藥超聲微泡(Ultrasound microbubble, UM)迅速、高效和安全的帶入并滯留在細(xì)胞內(nèi)部。但TATp缺乏細(xì)胞特異性。趨化因子SDF-1 (stromal cell-deried factor 1)又名為CXCL12,其唯一能與之結(jié)合并激活的受體為CXCR4,遠(yuǎn)高表達(dá)于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)(Metastatic lymph node, MLN)的舌鱗癌細(xì)胞膜上,在不同口腔鱗癌細(xì)胞中陽性表達(dá)率高達(dá)72.3%～89.6%。而凋亡素蛋白(apoptin或VP3)由雞貧血病毒(Chicken anemia virus, CAV)基因編碼,具有腫瘤細(xì)胞特異性。對正常細(xì)胞無毒性,也同時具有一定靶向性。采用乳化溶劑揮發(fā)法(WI/O/W2)制備出靶向載藥PLGA的UM,由于受到制備配方中多步驟的限制,仍然存在載藥量(Drug loading,DL)較低問題,于是優(yōu)化制備工藝成為必須。綜上,本課題主要旨在制備一種TATp與SDF-1修飾的新型載VP3基因靶向高分子UM,并優(yōu)化制備工藝,提高載藥量。通過體外尋找舌scc-15細(xì)胞,驗證所制得的UCA靶向性,從而為舌癌原發(fā)灶及其頸部淋巴道轉(zhuǎn)移組織的無創(chuàng)早期診斷和非手術(shù)治療提供一種新思路和新手段。本實驗分以下兩部分：第一部分靶向舌鱗癌細(xì)胞載基因超聲微泡的制備及其優(yōu)化目的：1.制備一種載VP3基因,并TATp與SDF-1同時修飾新型載基因高分子靶向UCA。并探討制備因素對其粒徑、載藥量、包封率等.影響,從而篩選出制備UM的最佳組合。2.評價該靶向UCA基本特性、對DNA保護(hù)性、體外釋放效果、分子成像效果以及TATp、SDF-1在高分子UM表面連接狀況。方法：1.采用WI/O/W2法及真空冷凍干燥法制備載VP3基因PLGA的UM,并使用單因素和正交分析實驗優(yōu)化其制備條件,提高載藥量。并通過硫醚鍵將SDF-1與TATp同時共價聯(lián)接到微泡表面,制備出靶向舌鱗癌細(xì)胞載VP3基因PLGA的UM(TATp-SDF-1-VP3-PLGA-UM,TSVP-UM)。2.普通光學(xué)顯微鏡觀察該UM形態(tài)以及分散性；Nano-Drop紫外分光光度計評估其載藥量及包封率；透射電鏡觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)；Malvern測量儀測定其粒徑以及分布、表面電位；流式細(xì)胞儀(Flow cytometry, FC)及激光掃描共聚焦熒光顯微鏡(Laser scanning confocal microscopy, LSCM)檢測TATp、 SDF-1在高分子UM表面連接狀況；酶切反應(yīng)實驗鑒定其對DNA保護(hù)性；Nano-Drop紫外分光光度計檢測其體外釋藥性能；彩色多普勒超聲成像診斷儀評價其體外成像效果。結(jié)果：1.使用單因素和正價分析所得最佳制備方案為VP3基因/PLGA質(zhì)量比為1.6%,VP3基因濃度為8ug/ul,水相／油相體積比(W1/O)為1：15。2.靶向載基因UM呈規(guī)則球形,分散性好。粒徑分布集中,大小以490.2-522.6nm之間為主,表面電位為-17-0mv。平均載藥量為0.86%,平均包封率為40.47%。對DNA保護(hù)作用持續(xù)60min,未見損壞。長達(dá)24天緩慢持久釋放VP3基因。單獨TATp、SDF-1與PLGA微泡表面連接率分別為98.37%、97.07%。同時加載TATp、SDF-1于PLGA微泡表面的連接率,TATp為69,84%、SDF-1為71.08%。體外超聲成像效果較好。結(jié)論：通過優(yōu)化制備工藝及化學(xué)硫醚鍵聯(lián)接成功制備出TSVP-UM。該UM粒徑滿足靜脈給藥需求,并具有載藥量較高、長效緩釋、體外成像效果較好的特性,兼具診斷和治療的理想載藥超聲造影劑系統(tǒng)的基本性能。第二部分靶向舌鱗癌細(xì)胞載基因超聲微泡制備及體外尋靶實驗實驗研究目的：按照優(yōu)化方案制備TSVP-UM。并初步探討其體外尋靶性能。方法：1.體外培養(yǎng)SCC-15細(xì)胞,接種6孔板,制備細(xì)胞爬片。2.按優(yōu)化參數(shù)制備靶向組TSVP-UM,以及非靶向組載VP3基因高分子超聲微泡(VP3-PEG-PLGA-UM, VPP-UM)。與細(xì)胞爬片共孵育30min～1h。3.光鏡下比較觀察兩組UM與SCC-15細(xì)胞結(jié)合情況,流式細(xì)胞儀量化兩者結(jié)合律。結(jié)果：1.光鏡觀察顯示,靶向微泡組TSVP-UM簇聚化SCC-15細(xì)胞膜區(qū)域,少量已穿過細(xì)胞膜進(jìn)入到胞質(zhì)內(nèi)部。而非靶向組VPP-UM較少粘附與細(xì)胞膜上。2.流式細(xì)胞儀半定量結(jié)果表明,靶向組聯(lián)接率為91.44%,非靶向組為12.96%。結(jié)論：體外尋靶驗證了TSVP-UM對SCC-15細(xì)胞具備較強(qiáng)靶向性。并且同時發(fā)現(xiàn)在較短時間內(nèi),TSVP-UM已少許穿膜進(jìn)入到SCC-15細(xì)胞內(nèi)部。初步驗證了TSVP-UM殼層聯(lián)接的TATp的生物活性。TSVP-UM作為一種非病毒基因載體有望成為一類作用于舌SCC及其淋巴道轉(zhuǎn)移組織、安全有效的基因傳遞系統(tǒng)。
【關(guān)鍵詞】：聚乳酸/羥基乙酸共聚物 超聲微泡 靶向舌鱗癌細(xì)胞 分子成像
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.8
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-19
• 第一部分 靶向舌鱗癌細(xì)胞載基因超聲微泡的優(yōu)化制備及評估19-40
• 第一節(jié) 靶向舌鱗癌細(xì)胞載VP_3基因高分子超聲微泡的制備及特性檢測19-28
• 1 材料與方法19-23
• 2 結(jié)果23-28
• 第二節(jié) 靶向舌鱗癌細(xì)胞載VP_3基因高分子超聲微泡制備優(yōu)化及特性檢測28-40
• 1 材料與方法28-33
• 2 結(jié)果33-38
• 3 討論38-40
• 第二部分 TATp和CXCR4修飾的載VP3基因超聲微泡體外導(dǎo)靶實驗研究40-47
• 1 材料與方法40-45
• 2 結(jié)果45-46
• 3 討論46-47
• 全文總結(jié)47-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 附圖55-56
• 文獻(xiàn)綜述56-65
• 參考文獻(xiàn)62-65
• 致謝65-66
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文66

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本文編號：756745