本文關(guān)鍵詞：TET1在人乳腺癌組織中的表達(dá)及其調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞株生物學(xué)行為的研究

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【摘要】：目的:乳腺癌是世界上女性最常見的惡性腫瘤。臨床上,腫瘤病人的死亡90%是由于腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移引起的。因此,探究乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制是現(xiàn)今的研究熱點(diǎn)。TET1是近年來發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)DNA去甲基化過程的重要蛋白,可通過催化5-甲基胞嘧啶(5m C)進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5hm C)參與DNA去甲基化和基因表達(dá)的調(diào)控。已有一些研究證實(shí),在人類實(shí)體腫瘤中TET基因突變與5hm C水平的改變與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后有著顯著相關(guān)性,但其具體作用機(jī)制眾說不一。為此,本研究首先通過檢測乳腺癌組織及良性乳腺病變組織中TET1的表達(dá)情況,探究TET1與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)之間的關(guān)系;隨后測定了TET1在不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況;最后通過建立高表達(dá)TET1的MCF-7細(xì)胞株,研究TET1對MCF-7細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及遷移能力的影響,并初步探究其相關(guān)分子機(jī)制,以期為臨床治療腫瘤提供新的靶點(diǎn)。方法:1隨機(jī)收集2012年1月至2014年6月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心收治的原發(fā)性乳腺癌患者62例,并收集乳腺良性病變患者10例作為對照組。隨后于我院病理科采用免疫組化Max Vision TM一步法檢測所有患者術(shù)后病理組織的TET1表達(dá),結(jié)合患者年齡、術(shù)后的腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、病理學(xué)分期、組織學(xué)分級、是否有脈管瘤栓、分子分型及ER、PR、HER-2、P53及Ki-67的表達(dá)情況,探討TET1的表達(dá)與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系。2應(yīng)用PCR及Western blot檢測SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453四種乳腺癌細(xì)胞系中TET1的表達(dá)情況,并以非腫瘤源性腎上皮細(xì)胞HEK293及臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)作為對照進(jìn)行比較分析。3應(yīng)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法,建立TET1高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(MCF-7-TET1)及攜帶e GFP的陰性對照組穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株(MCF-7-vector),CYBRGreen法實(shí)時(shí)定量PCR檢測TET1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)狀況。4倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài),以MCF-7-vector作為陰性對照,以MCF-7作為空白對照,應(yīng)用CCK-8法檢測高表達(dá)TET1對MCF-7細(xì)胞增殖的影響,應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測TET1對細(xì)胞周期的影響,利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測TET1對細(xì)胞遷移能力的作用,并應(yīng)用q PCR檢測EMT相關(guān)基因(CDH1、VIM、TGFB1、CTNNB1)在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。5應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,免疫組化結(jié)果采用卡方檢驗(yàn)及Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)。兩獨(dú)立樣本的比較應(yīng)用成組t檢驗(yàn)分析,多組間均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析,多樣本均數(shù)間多重比較應(yīng)用Tukey檢驗(yàn),數(shù)據(jù)用mean±SD表示,每組實(shí)驗(yàn)不少于3個獨(dú)立樣本的重復(fù),以P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1在62例原發(fā)性乳腺癌標(biāo)本中,TET1低表達(dá)者共33例,高表達(dá)者共29例,原發(fā)性乳腺癌中的TET1低表達(dá)率為53.23%;在10例乳腺良性病變標(biāo)本中TET1低表達(dá)者0例,高表達(dá)者共10例,乳腺良性病變的TET1低表達(dá)率為0%。TET1在原發(fā)性乳腺癌組織及乳腺良性病變中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=7.799,P=0.005。2根據(jù)腫瘤大小,將62例原發(fā)性乳腺癌患者分為≤2cm組,共32例,2cm組,共30例,TET1在兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=3.218,P=0.040。3根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù),將62例患者分為無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,共29例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組,共33例。TET1在兩組間的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=5.120,P=0.024。4根據(jù)病理學(xué)分期,將62例患者分為0~Ⅰ期組,共19例;Ⅱ期組,共23例;Ⅲ期組,共20例。三組間TET1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=11.480,P=0.003。采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn),TET1的表達(dá)水平與病理學(xué)分期成負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=-0343,P=0.006。5根據(jù)組織學(xué)分級,將62例患者分為Ⅱ級組,共36例;Ⅲ級組,共20例;不能判定者6例。兩組間TET1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=4.134,P=0.042。6根據(jù)術(shù)后病理中的脈管瘤栓情況,將62例患者分為有脈管瘤栓組,共35例;無脈管瘤栓組,共26例;無法判定者1例。兩組間TET1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=9.932,P=0.002。7 TET1在不同分子分型乳腺癌中的表達(dá)無明顯差異,TET1的表達(dá)與患者年齡及Ki-67、HER-2、ER、PR、P53的表達(dá)無關(guān)(P0.05)。8 RT-PCR測定HEK-293、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-453、hmsc六種細(xì)胞的TET1 m RNA的相對表達(dá)量分別為0.399±0.007,0.073±0.005,0.103±0.002,0.088±0.003,0.111±0.003,0.025±0.001;q PCR測定以上六種細(xì)胞中TET1 m RNA的相對表達(dá)量分別為1.070±0.250,0.260±0.150,0.160±0.100,0.060±0.020,0.190±0.220,0.080±0.050,HEK-293細(xì)胞系中的TET1 m RNA表達(dá)量與其余細(xì)胞進(jìn)行比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。Western blot法測定六種細(xì)胞中TET1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.252±0.016,0.773±0.008,0.789±0.029,0.860±0.061,0.672±0.002,1.711±0.093。將HEK-293及hmsc細(xì)胞中的TET1蛋白表達(dá)量與其余細(xì)胞進(jìn)行比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)9成功建立高表達(dá)TET1的MCF-7細(xì)胞模型,收集MCF-7、MCF-7-vector應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測熒光細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度,兩者的熒光細(xì)胞數(shù)(%)分別為:3.067±0.006和97.557±0.090;熒光強(qiáng)度分別為:11.873±0.111和3320.353±41.787,MCF-7-vector細(xì)胞熒光細(xì)胞數(shù)及熒光強(qiáng)度顯著增加,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CYBRGreen法q PCR檢測TET1 m RNA表達(dá),結(jié)果顯示,與空白對照組MCF-7相比,MCF-7-TET1細(xì)胞中TET1上調(diào)203.75±25.67倍;與陰性對照組MCF-7-vector相比,MCF-7-TET1細(xì)胞中TET1上調(diào)70.09±38.47倍,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力,空白對照(MCF-7)及陰性對照組(MCF-7-vector)細(xì)胞增殖未見明顯差異(P0.05),而MCF-7-TET1細(xì)胞增殖能力明顯減低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。11流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,在培養(yǎng)72h后,空白對照及陰性對照組各細(xì)胞周期間無顯著差異(P0.05),而與兩組對照組細(xì)胞相比,MCF-7-TET1組細(xì)胞雖sub-G0期未見明顯變化,但G0/G1期比例明顯增加:空白對照及陰性對照組細(xì)胞G0/G1期分別占45.57±2.23%、45.29±0.71%,而MCF-7-TET1細(xì)胞G0/G1期占57.96±0.74%;同時(shí)伴有S期及G2/M期比例明顯減低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。12細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤細(xì)胞遷移能力,與空白對照(MCF-7)及陰性對照組(MCF-7-vector)相比,MCF-7-TET1細(xì)胞遷移能力顯著下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。13 q PCR檢測各組細(xì)胞中EMT相關(guān)基因的表達(dá),其中CDH1及CTNNB1表達(dá)增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),而VIM及TGFB1表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1 TET1在原發(fā)性乳腺癌組織中的表達(dá)較良性乳腺病變組織明顯降低;TET1低表達(dá)于腫瘤2cm、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分期較晚、高組織學(xué)分級及有脈管瘤栓有關(guān),可協(xié)助判斷病情。2相較于非腫瘤源性上皮細(xì)胞,TET1在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯降低。3成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TET1的MCF-7-TET1細(xì)胞株及相應(yīng)對照細(xì)胞株MCF-7-vector。4 TET1通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖。5 TET1抑制MCF-7細(xì)胞遷移,其機(jī)制可能與通過Wnt/β-catenin通路抑制EMT的發(fā)生相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：乳腺癌 TET1 細(xì)胞周期 細(xì)胞增殖 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-15
• 引言15-17
• 參考文獻(xiàn)16-17
• 第一部分 TET1 在人乳腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系17-31
• 前言17
• 材料與方法17-19
• 結(jié)果19-22
• 附圖22-25
• 附表25-27
• 討論27-29
• 小結(jié)29
• 參考文獻(xiàn)29-31
• 第二部分 TET1 在不同細(xì)胞系中的表達(dá)及其對MCF-7 細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機(jī)制31-70
• 前言31
• 材料與方法31-46
• 結(jié)果46-49
• 附圖49-61
• 附表61-64
• 討論64-66
• 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-70
• 結(jié)論70-71
• 綜述 TET家族及DNA甲基化在腫瘤中作用機(jī)制的研究進(jìn)展71-85
• 參考文獻(xiàn)77-85
• 致謝85-86
• 個人簡歷86

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳怡晨;凌志強(qiáng);;TET家族DNA羥化酶與5-hmC在腫瘤中的作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2013年12期

2 郭曉強(qiáng);王越甲;郭振清;常彥忠;段相林;;TET蛋白:一個新的DNA修飾酶家族[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2011年12期

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本文編號：751318