本文關(guān)鍵詞：人源甲狀腺未分化癌噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選

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【摘要】：目的：構(gòu)建天然人源甲狀腺未分化癌噬菌體單鏈抗體庫,并初步篩選出抗甲狀腺未分化癌抗體。方法：提取ATC病人癌周淋巴結(jié)總RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA。以此cDNA為模板分別擴增VH、VL基因片斷,并與相應(yīng)Linker連接；再采取重疊延伸PCR技術(shù)拼接組裝成scFv基因片段。隨后引入酶切位點sfiⅠ和NotⅠ,連接經(jīng)雙酶切后的scFv重組基因片段與質(zhì)粒pCANTAB-5E。產(chǎn)物經(jīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1,超感染噬菌體,構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫。最后采用甲狀腺未分化癌細胞為抗原對建立的抗體庫進行4輪“吸附、洗脫、擴增”的篩選,并應(yīng)用ELSIA方法鑒定其特異性。結(jié)果：成功獲得約為750 bp的scFv基因。用pUC19標準質(zhì)粒測定轉(zhuǎn)化效率達到108 cfu/μg,雙酶切鑒定scFv基因的陽性插入率為86.4%(19/22)。經(jīng)過四輪親和篩選,針對甲狀腺未分化癌細胞的單鏈抗體得到明顯富集,第四輪收獲率為第一輪的77倍。ELSIA結(jié)果顯示篩選出的抗體與甲狀腺未分化癌細胞有特異的結(jié)合能力。結(jié)論：成功構(gòu)建了人源甲狀腺未分化癌噬菌體單鏈抗體庫,并從中篩選出具有甲狀腺未分化癌細胞特異性的人源噬菌體單鏈抗體。為下一步放免研究打下基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：噬菌體展示技術(shù) 噬菌體單鏈抗體 甲狀腺未分化癌 構(gòu)建 篩選
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R736.1
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 第一部分：人源甲狀腺未分化癌單鏈抗體庫的構(gòu)建11-32
• 前言11-12
• 1 材料12-16
• 1.1 主要試劑12
• 1.2 主要儀器12-13
• 1.3 試劑制備13-15
• 1.4 PCR引物15-16
• 2 方法16-25
• 2.1 總RNA提取16-18
• 2.2 擴增VH、VL18-19
• 2.3 擴增scFv基因19-21
• 2.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒21-22
• 2.5 噬菌體抗體文庫的構(gòu)建22-23
• 2.6 抽提質(zhì)粒和初步鑒定23-25
• 2.7 噬菌體抗體文庫表達25
• 2.8 噬菌體滴度測定25
• 3 結(jié)果25-29
• 3.1 淋巴結(jié)總RNA25-26
• 3.2 VH、VL基因鑒定26-27
• 3.3 scFv基因的組裝27-28
• 3.4 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率28
• 3.5 重組質(zhì)粒的鑒定28-29
• 4 討論29-31
• 5 小結(jié)31-32
• 第二部分：人源甲狀腺未分化癌單鏈抗體庫的篩選32-43
• 前言32
• 1 材料32-34
• 1.1 實驗材料32-33
• 1.2 實驗試劑33-34
• 2 方法34-36
• 2.1 細胞培養(yǎng)34-35
• 2.2 人源甲狀腺未分化癌噬菌體scFv的淘篩35-36
• 2.3 Phage ELisa鑒定scFv特異性36
• 3 結(jié)果36-39
• 3.1 抗體庫的篩選36-37
• 3.2 ELSA鑒定37-39
• 4 討論39-42
• 5 小結(jié)42-43
• 全文總結(jié)43-44
• 參考文獻44-49
• 文獻綜述49-57
• 參考文獻53-57
• 致謝57-58
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文58

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本文編號：751329