本文關(guān)鍵詞：PNPLA3基因I148M多態(tài)性對肝癌細胞Huh-7細胞周期的影響

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【摘要】：目的構(gòu)建穩(wěn)定表達PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突變型的Huh-7細胞株,在此基礎(chǔ)上探討PNPLA3基因I148M多態(tài)性對人Huh-7細胞周期的影響及相關(guān)機制。方法雙酶切PNPLA3基因野生型及PNPLA3基因I148M突變型的基因序列與載體序列,并使目的基因分別與載體連接,純化并擴增獲得含有目的基因的載體質(zhì)粒;獲得的載體質(zhì)粒和病毒輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,獲得攜帶目的基因的高滴度的慢病毒;慢病毒轉(zhuǎn)染Huh-7細胞,篩選并構(gòu)建穩(wěn)定表達PNPLA3基因野生型和PNPLA3基因I148M突變型的Huh-7細胞株;在此基礎(chǔ)上以空載體Huh-7細胞為對照,流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染的Huh-7細胞周期,Western blot方法及熒光定量PCR分別檢測細胞周期調(diào)節(jié)因子Cyclin D1及p53的表達情況。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件,定量資料的數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差”表示,兩組間比較分別采用獨立樣本t檢驗或χ2檢驗;P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果(1)成功構(gòu)建載體質(zhì)粒:陽性克隆菌液進行測序,測序結(jié)果證實載體質(zhì)粒攜帶目的基因完整編碼序列。(2)慢病毒載體構(gòu)建成功并獲得足夠滴度(1×10^8PFU/ml)的慢病毒載體:倒置熒光顯微鏡下顯示攜帶目的基因的慢病毒載體在293T細胞中成功組裝,嘌呤霉素篩選后表達出明亮的綠色熒光蛋白。(3)慢病毒成功感染Huh-7細胞:倒置熒光顯微鏡下顯示嘌呤霉素篩選后綠色熒光蛋白陽性表達率95%;Western blot結(jié)果顯示突變型組與野生型組目的蛋白的表達明顯高于對照組;熒光定量PCR結(jié)果顯示突變型組及野生型組PNPLA3 mRNA的相對表達(突變型166.65±117.25,野生型1149.55±278.17)分別明顯高于對照組(1.02±0.23,P0.05)。(4)PNPLA3基因I148M多態(tài)性導(dǎo)致Huh-7細胞周期紊亂:三組間各細胞周期細胞所占比例(%)的兩兩比較顯示野生型組細胞周期G1期(58.53±0.35),G2/M期(24.87±0.60),S期(16.60±0.26)參數(shù)與對照組對應(yīng)各期(G1期59.27±0.15;G2/M期24.23±0.31;S期16.50±0.26)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;突變型組與野生型組相比,G1期細胞比例減少(突變型G1期38.37±0.21,P0.05),S期與G2/M期細胞比例相應(yīng)增加(突變型S期27.47±0.35,G2/M期34.17±0.15,P0.05)。(5)周期相關(guān)蛋白P53表達顯著增強,Cyclin D1表達水平無明顯差異:與對照組相比,突變型組的P53 mRNA相對表達量明顯上調(diào)(對照組1.06±0.41,突變型組6.54±0.34;P0.05);野生型組P53 mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(1.66±0.30,P0.05)。Cyclin D1 mRNA各組中的相對表達量均無明顯差異(對照組1.00±0.10,野生型組1.06±0.03,突變型,1.11±0.04;P0.05)。結(jié)論PNPLA3基因I148M突變可能促進Huh-7細胞DNA的復(fù)制,加速細胞周期,從而促進肝癌細胞生長。上調(diào)p53的表達參與了此過程。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒 PNPLA3 I148M 細胞周期 p53
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第1章 構(gòu)建穩(wěn)定表達目的基因的Huh-7 細胞系9-21
• 1.1 實驗材料9-11
• 1.1.1 主要儀器和設(shè)備9
• 1.1.2 主要試劑和器材9-11
• 1.2 實驗方法11-21
• 1.2.1 Huh-7 細胞的培養(yǎng)11-12
• 1.2.2 目的基因過表達慢病毒的構(gòu)建12-15
• 1.2.3 慢病毒載體構(gòu)建15-17
• 1.2.4 慢病毒包裝17-18
• 1.2.5 慢病毒轉(zhuǎn)染Huh-7 細胞18-19
• 1.2.6 驗證目的基因的表達19-21
• 1.2.6.1 Western Blot驗證PNPLA3蛋白的表達19-20
• 1.2.6.2 熒光定量PCR驗證PNPLA3基因mRNA的表達20-21
• 第2章 PNPLA3基因I148M多態(tài)性對Huh-7 細胞周期的影響21-24
• 2.1 實驗材料21-22
• 2.2 實驗方法22-24
• 2.2.1 細胞周期的測定22
• 2.2.2 Western Blot測定周期相關(guān)蛋白的表達22
• 2.2.3 熒光定量PCR測定周期相關(guān)蛋白mRNA的表達22-24
• 第3章 結(jié)果24-33
• 3.1 載體質(zhì)粒構(gòu)建成功24-28
• 3.2 慢病毒載體構(gòu)建成功28-29
• 3.3 慢病毒成功感染Huh-7 細胞29-30
• 3.4 PNPLA3成功過表達30-31
• 3.5 PNPLA3基因I148M多態(tài)性影響Huh-7 細胞的細胞周期31-32
• 3.6 Western blot檢測p53，cyclin D1蛋白的表達32
• 3.7 熒光定量PCR檢測P53，cyclin D1 mRNA相對表達32-33
• 第4章 討論33-34
• 第5章 結(jié)論34-35
• 參考文獻35-39
• 綜述39-50
• 綜述參考文獻43-50
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果50-51
• 縮略詞51-52
• 致謝52-53

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 徐靜;辛永寧;宣世英;;PNPLA3基因多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病關(guān)系的研究進展[J];臨床肝膽病雜志;2012年04期

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本文編號：746197