發(fā)布時間：2017-08-27 06:00

  本文關鍵詞：前列腺癌AR復合體通過甲基化抑制YAP1的表達

  更多相關文章： 前列腺癌 甲基化 Yes-相關蛋白1 雄激素受體 DNA甲基轉移酶3a EZH2

【摘要】：目的:應用體內體外實驗檢測前列腺癌中雄激素受體(AR)對Yes相關蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)的調節(jié)作用,并進一步探討AR調節(jié)YAP1的作用機制。方法:應用免疫組織化學的方法分別檢測三個時間點兩種轉基因鼠(AR-wt AR-KO)的YAP1的表達差異,應用蛋白免疫印跡(Western Blotting)的方法分別檢測前列腺癌細胞中抑制AR(使用AR的抑制劑)和激活AR(過表達AR)后YAP1蛋白表達的變化,應用IHC及Western Blotting兩種技術分別檢測不同的人前列腺疾病標本(BPH、ADPC、CRPC)的YAP1的表達差異。應用實時定量PCR技術(qPCR)的方法檢測敲低AR(通過siRNA)后YAP1及其下游基因的mRNA變化,應用Luciferase報告基因技術分別檢測抑制AR(通過siRNA敲低AR以及使用AR的抑制劑兩種不同的方法)和激活AR后YAP1的啟動子區(qū)活性。應用甲基化特異性PCR(MSP)的方法檢測雄激素依賴的AR對YAP1啟動子區(qū)甲基化的調節(jié)作用。應用蛋白免疫印跡、qPCR和Luciferase報告基因技術分析依賴AR的DNA甲基轉移酶3a(DNMT3a)對YAP1的調節(jié)作用。應用染色質免疫沉淀技術(ChIP-MSP)驗證DNMT3a、AR對YAP1的甲基化的調節(jié)作用。應用免疫共沉淀技術(CoIP)、染色質免疫共沉淀技術(ChIP-qPCR)驗證AR、DNMT3a、EZH2三者的相互作用及其調節(jié)YAP1的機制。結果:1.前列腺癌中AR抑制YAP1的表達。人前列腺組織中,YAP1主要表達于AR陰性、CK5陽性的基底上皮細胞(basal epithelial cells)的核內,而高表達AR的腔上皮細胞(luminal cells)則表達極少量的細胞內彌散分布的YAP1。去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)中YAP1的表達明顯高于激素依賴性前列腺癌(ADPC)。2.qPCR結果證實敲低AR后,YAP1及其下游基因的mRNA上調。Luciferase報告基因實驗證實抑制AR能提高YAP1的啟動子區(qū)活性,而雙氫睪酮(DHT)刺激AR能抑制YAP1的啟動子區(qū)活性。3.MSP結果顯示DHT激活AR后,YAP1啟動子區(qū)CpG位點的甲基化水平上調,繼而用MDV3100抑制AR活性后,上調的甲基化回落。4.DNMT3a在轉錄水平抑制YAP1的表達,這種抑制作用有賴于雄激素激活的AR,同時AR抑制YAP1的轉錄亦依賴DNMT3a,進一步的ChIP-MSP實驗證實,相比于非甲基化位點,DNMT3a和AR更多地結合在YAP1的啟動子區(qū)甲基化位點。5.CoIP實驗證實AR、DNMT3a、EZH2互相結合形成復合體,ChIP-qPCR實驗進一步證實AR-DNMT3a-EZH2復合體結合于YAP1的啟動子區(qū),并且這種結合是雄激素依賴性的。EZH2的抑制劑DZNep能抑制復合體的形成與發(fā)揮作用,相反地,H3K27去甲基化酶抑制劑GSKJ1能促進復合體的形成與發(fā)揮作用。結論:前列腺組織中,YAP1主要表達于基底上皮細胞的核內,而腔上皮細胞則表達少量的細胞內彌散分布的YAP1。CRPC中YAP1的表達明顯高于ADPC。前列腺癌中AR能夠抑制YAP1的表達,并且這種抑制作用依賴于AR與DNMT3a、EZH2相互結合形成復合體,此復合體結合于YAP1的啟動子區(qū),繼而促進YAP1的啟動子區(qū)CpG位點的甲基化。CRPC階段,AR、DNMT3a和EZH2對YAP1的甲基化調節(jié)過程明顯抑制,從而導致YAP1高表達,此過程對CRPC階段前列腺癌細胞的生長至關重要,這也為我們提供了一個治療CRPC的潛在靶點。
【關鍵詞】：前列腺癌 甲基化 Yes-相關蛋白1 雄激素受體 DNA甲基轉移酶3a EZH2
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-15
• 研究現狀、成果11-14
• 研究目的、方法14-15
• 一、Androgen-AR信號通路抑制YAP1表達15-33
• 1.1 對象和方法15-27
• 1.1.1 研究對象15-16
• 1.1.2 實驗材料16-18
• 1.1.3 實驗方法18-27
• 1.2 結果27-30
• 1.2.1 TRAMP鼠敲除AR后YAP1蛋白表達的變化27-28
• 1.2.2 前列腺癌細胞中改變AR活性后YAP1蛋白的變化28-29
• 1.2.3 不同人前列腺組織中YAP1的表達差異29-30
• 1.3 討論30-31
• 1.4 小結31-33
• 二、AR與DNMT3a、EZH2形成復合體，甲基化抑制YAP133-53
• 2.1 對象和方法33-46
• 2.1.1 研究對象33
• 2.1.2 實驗材料33-37
• 2.1.3 實驗方法37-46
• 2.2 結果46-49
• 2.2.1 AR主要在轉錄水平調節(jié)YAP1的表達46-47
• 2.2.2 AR通過DNMT3a依賴的甲基化方式調節(jié)YAP147-48
• 2.2.3 AR與DNMT3a、EZH2相互結合在YAP1的啟動子區(qū)48-49
• 2.3 討論49-52
• 2.4 小結52-53
• 結論53-54
• 參考文獻54-57
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明57-58
• 綜述 YAP與多種惡性腫瘤相關性的研究進展58-74
• 綜述參考文獻66-74
• 致謝74-75
• 個人簡歷75

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本文編號：744681