發(fā)布時間：2017-08-27 05:32

  本文關鍵詞：染料木黃酮與內源性雌二醇對人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和T47D雙向作用后差異表達基因的篩選與驗證分析

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【摘要】：目的乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,嚴重影響患者的生存質量。現(xiàn)認為乳腺癌的發(fā)病是許多基因異常表達的結果,尋找乳腺癌發(fā)生過程中表達水平發(fā)生變化的基因及阻止腫瘤發(fā)生發(fā)展的靶點成為腺癌研究中亟待解決的難題。大豆染料木黃酮作為大豆食品中重要的活性成分,主要產生雌激素和抗雌激素作用來體現(xiàn)其抗乳腺癌活性,使乳腺癌的發(fā)病率不斷下降,受到了人們的廣泛關注。其作為類雌激素與人體內源性激素對女性乳腺癌的共同影響是決定其防控乳腺癌作用效果的關鍵點,此外,雌激素受體類型不同,染料木黃酮生物學效應存在較大差別。本研究通過染料木黃酮與不同水平(80,800 pmol/L,婦女絕經(jīng)前后)內源性雌二醇共同作用于人乳腺癌細胞系MDA-MB-231口T47D,利用基因芯片高通量的優(yōu)點,對染料木黃酮與內源性雌二醇雙向作用于兩株乳腺癌細胞后行差異表達基因的篩選與驗證分析。獲取不同雌激素受體下乳腺癌細胞的關鍵差異基因和信號通路,對差異表達基因作用路徑進行分析,探討可疑基因群中基因的作用通路以及基因之間的相互作用,找出染料木黃酮抑制乳腺癌作用的分子機制和對不同雌激素受體下乳腺癌細胞的抑制差異,為其在乳腺癌的預防、治療上的應用提供科學證據(jù)。方法對前期所獲得的雌二醇與染料木黃酮共同作用于人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和T47D后基因芯片數(shù)據(jù)進行歸一化處理,根據(jù)倍數(shù)差異(FC≤0.5或FC≥2)和方差分析篩選差異性表達基因,FC≥2認為該基因表達上調,FC0.5認為該基因表達下調。通過DAVID(The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)在線分析工具對這組差異表達基因進行基因功能的注釋和基因富集分析,篩選出與腫瘤進展相關的功能類,在這些功能類中挑選差異倍數(shù)較高且參與多個功能類的基因進行實時熒光定量PCR驗證。結果1、用不同濃度染料木黃酮與內源性雌二醇共同處理乳腺癌細胞系MDA-MB-231和T47D后,對各處理組的基因芯片數(shù)據(jù)進行差異基因的篩選,篩選標準為P0.01, FC (Fold Chang)≥2或FC0.5。(1)當兩株乳腺癌細胞中沒有加入染料木黃酮,只是根據(jù)絕經(jīng)前后身體里不同雌激素水平加入相對應的雌激素受試物80,800 pmol/L時。按照篩選標準,乳腺癌細胞MDA-MB-231中共有134個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調98個,下調36個；乳腺癌細胞T47D中共有122個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調85個,下調37個。(2)當兩株乳腺癌細胞中加入染料木黃酮濃度為20μmol/L,雌激素水平根據(jù)絕經(jīng)前后身體里不同濃度加入相對應的雌激素受試物即80,800 pmol/L時。按照篩選標準,乳腺癌細胞MDA-MB-231中共有395個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調229個,下調166個；乳腺癌細胞T47D中共有503個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調313個,下調190個。(3)當兩株乳腺癌細胞雌激素濃度為絕經(jīng)后(80Pmol/L)水平時,加入染料木黃酮濃度為20μmol/L時,可獲得染料木黃酮對絕經(jīng)后雌激素水平下兩株乳腺癌細胞的影響結果。按照篩選標準,乳腺癌細胞MDA-MB-231中共有151個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調57個,下調94個；乳腺癌細胞T47D中共有136個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調50個,下調86個。(4)當兩株乳腺癌細胞雌激素濃度為絕經(jīng)前(800Pmol/L)水平時,加入染料木黃酮濃度為20μmol/L時,可獲得染料木黃酮對絕經(jīng)前雌激素水平下兩株乳腺癌細胞的影響結果。按照篩選標準,乳腺癌細胞MDA-MB-231中共有56個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調29個,下調27個；乳腺癌細胞T47D中共有80個基因表達發(fā)生顯著變化,其中上調39個,下調41個。2、以受試物E2為0 pmol/L, Gen Oμmol/L作空白對照,受試物E2為0 pmol/L, Gen 20μmol/為試驗組時,通過進行實時定量PCR實驗驗證,從實驗組中篩選出的BRCA2、CDKN1A、ABAT、FAS、TP53TG3、SDCBP等6個基因表達水平比對照組顯著上調,TNF基因表達水平顯著下調,與芯片篩選結果一致；EGFR基因表達水平顯著下調,芯片篩選結果不一致。結論Gen對ERa陰性的乳腺癌細胞MDA-MB-231無論是絕經(jīng)前還是絕經(jīng)后都起到保護作用；雌激素水平在絕經(jīng)前時Gen抑制T47D的增殖和生長,雌激素水平為絕經(jīng)后時Gen促進T47D生長。Gen對乳腺癌細胞的影響除跟體內雌激素水平相關外,還和乳腺癌細胞中ER的類型相關。主要表現(xiàn)在Gen對ER信號通路在磷酸化水平和轉錄水平上均產生一定的影響；具體表現(xiàn)為對雌激素受體ER-a的作用上,Gen阻止了ER-α第537位酪氨酸殘基的磷酸化而抑制酪氨酸激酶活性,使ER二聚化不能形成,阻斷其信號傳遞。
【關鍵詞】：染料木黃酮 內源性雌激素 雌激素受體 乳腺癌細胞 差異基因
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 1 實驗材料18-20
• 1.1 實驗藥品和試劑18
• 1.2 實驗細胞株18
• 1.3 實驗儀器和耗材18-20
• 2 實驗方法20-27
• 2.1 細胞培養(yǎng)前的準備20-21
• 2.2 細胞株的培養(yǎng)和受試物的添加21-22
• 2.3 實時熒光定量PCR驗證差異基因22-26
• 2.4 統(tǒng)計方法26-27
• 3 結果27-63
• 3.1 差異表達基因的篩選27-57
• 3.2 實時熒光定量PCR驗證芯片結果57-63
• 4 討論63-66
• 4.1 雌激素受體對乳腺癌細胞的影響作用63
• 4.2 不同雌激素水平下加入Gen時對乳腺癌細胞的影響63-64
• 4.3 染料木黃酮、雌激素和雌激素受體的交互作用64-66
• 5 結論66-67
• 參考文獻67-71
• 綜述71-78
• 參考文獻75-78
• 攻讀學位期間獲得的學術成果78-79
• 致謝79

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本文編號：744611