本文關(guān)鍵詞：SFRP5沉默對人膽管癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

  更多相關(guān)文章： SFRP5 膽管癌 信號傳導(dǎo) 靶基因修復(fù)

【摘要】：研究目的:探討使用慢病毒介導(dǎo)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)沉默SFRP5(secreted frizzled-related proteins-5,SFRP5)基因?qū)θ祟惸懝馨㏑BE細(xì)胞株增殖、遷移以及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。研究方法:對人膽管癌RBE細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng),制備設(shè)計(jì)SFRP5干擾片段,使用慢病毒載體p LVX-sh RNA2構(gòu)建慢病毒載體質(zhì)粒,并進(jìn)行基因測序鑒定,將構(gòu)建好的慢病毒sh RNA載體以及輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得重組慢病毒,利用梯度測定法測定慢病毒滴度,使用Fu GENE?HD轉(zhuǎn)染試劑將慢病毒轉(zhuǎn)染入RBE細(xì)胞株,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的RBE細(xì)胞株,利用Western blot印跡法檢測SFRP5-si RNA干擾組以及對照組的SFRP5蛋白表達(dá)水平變化,通過細(xì)胞免疫熒光染色檢測SFRP5在RBE細(xì)胞中的表達(dá)情況,利用Real-time PCR檢測SFRP5-si RNA干擾組以及對照組m RNA表達(dá)水平的變化,通過Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究SFRP5沉默對膽管癌細(xì)胞的遷移能力的變化,使用CCK-8法檢測SFRP5低表達(dá)對膽管癌細(xì)胞增殖水平的影響,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測SFRP5低表達(dá)對膽管癌細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示RBE細(xì)胞株呈SFRP5陽性,故使用RBE細(xì)胞實(shí)行后續(xù)實(shí)驗(yàn),將慢病毒RNA干擾慢病毒載體及其輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞后,在熒光倒置顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染成功的293T細(xì)胞表達(dá)綠色熒光,慢病毒濃縮后測得滴度為1×109 TU/ml,測序結(jié)果呈陽性;重組慢病毒成功轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞,48h后通過熒光倒置顯微鏡可見綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率約達(dá)90%;Western blot結(jié)果顯示,與對照組對比,SFRP5-si RNA干擾組組蛋白表達(dá)明顯抑制,同時(shí)RT-PCR結(jié)果顯示,SFRP5-si RNA干擾組細(xì)胞株SFRP5基因m RNA表達(dá)水平明顯降低(p=0.0087),證實(shí)重組SFRP5慢病毒載體能夠有效抑制RBE細(xì)胞m RNA和蛋白表達(dá)水平;CCK-8法檢測結(jié)果顯示,與對照組對比,SFRP5-si RNA干擾組增殖活性明顯增加(p0.05);同時(shí)Transwell法檢測結(jié)果顯示,SFRP5-sh RNA-RBE組的穿膜細(xì)胞數(shù)約為[(310±15.63)個(gè)],較NC-sh RNA-RBE組的穿膜細(xì)胞數(shù)[(75±8.6)個(gè)]明顯增加(p0.05);同時(shí)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示劃痕后的12h及24h時(shí),SFRP5-si RNA干擾組細(xì)胞遷移率顯著大于對照組(p0.05);流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,SFRP5-si RNA干擾組細(xì)胞凋亡率(2.3%)明顯低于對照組(12.3%),且處于G1期的SFRP5-si RNA干擾組細(xì)胞多于對照組(p0.05)。結(jié)論:SFRP5可能在肝內(nèi)膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)節(jié)作用,SFRP5低表達(dá)激活wnt信號通路,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,本文得出以下結(jié)論:人肝內(nèi)膽管癌RBE細(xì)胞株中,沉默SFRP5基因表達(dá)可顯著增強(qiáng)RBE細(xì)胞的增殖和遷移能力,SFRP5的沉默抑制細(xì)胞凋亡,SFRP5在膽管癌細(xì)胞RBE中起到抑癌作用。
【關(guān)鍵詞】：SFRP5 膽管癌 信號傳導(dǎo) 靶基因修復(fù)
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.8
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 縮略詞7-9
• 前言9-12
• 第一部分 SFRP5慢病毒載體的設(shè)計(jì)以及構(gòu)建12-22
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料12-14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法14-18
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果18-21
• 1.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)21-22
• 第二部分 沉默SFRP5基因?qū)θ祟惸懝馨┑挠绊?/span>22-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-33
• 2.4 實(shí)驗(yàn)小結(jié)33-34
• 討論34-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-40
• 綜述：分泌型卷曲相關(guān)蛋白家族在腫瘤中的研究進(jìn)展40-46
• 參考文獻(xiàn)44-46
• 在學(xué)期間的研究成果46-47
• 致謝47

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