本文關鍵詞：腫瘤浸潤淋巴細胞在卵巢癌中的基礎和臨床研究

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【摘要】：研究背景卵巢癌是常見婦科惡性腫瘤之一,由于發(fā)病隱匿、腫瘤異質性以及高轉移率等,大多數(shù)患者就診時己處于晚期,從而使其死亡率高居女性生殖道惡性腫瘤之首。隨著手術和化療的發(fā)展,卵巢癌的治療雖然取得了一定的療效,但在疾病發(fā)展過程中,仍有大約三分之二的卵巢癌患者會出現(xiàn)惡性腹腔積液。惡性腹水可嚴重影響患者的生活質量,并引起一系列腹水相關癥狀包括腹脹、腹痛、呼吸困難、惡心、嘔吐、食欲不振、乏力等,同時也是降低患者總生存時間的獨立危險因素。盡管治療卵巢癌惡性腹水的方法有許多,包括原發(fā)腫瘤的治療、腹腔穿刺引流、利尿、低鹽飲食等,但大部分方法的療效有限,同時患者對上述方法的耐受程度也是有限的。由于目前尚無針對卵巢癌惡性腹水規(guī)范的治療指南,腹水一旦復發(fā)或者耐藥,其治療將變得異常棘手和極具挑戰(zhàn)性。因此,迫切需要尋找一種新興而有效持久治療卵巢癌惡性腹水的治療手段。近年來,隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制的深入研究以及生物技術的迅速發(fā)展,生物治療已成為繼傳統(tǒng)的手術、化療、放療等傳統(tǒng)療法之外的第四種有效的抗腫瘤治療方法。腫瘤的生物治療是通過調動宿主的天然防衛(wèi)機制或給予天然產生的靶向性很強的物質來取得抗瘤效應的新療法,其中過繼性細胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式。過繼性細胞免疫治療是運用生物技術和生物制劑對患者體內采集的免疫細胞如細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)、樹突狀細胞(DC)、NK細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte, TILs)等進行體外培養(yǎng)和大量擴增后再回輸至患者體內,從而激發(fā)及增強機體自身免疫功能來達到治療腫瘤的方法。其中過繼性TILs免疫治療策略是目前最具有發(fā)展?jié)摿Φ募毎煼�。TILs是存在于腫瘤間質內的具有抗原特異性的以淋巴細胞為主的致敏淋巴細胞群體。TILs經(jīng)體外生物制劑如重組人白介素-2(rInterleukin-2, rIL-2)刺激活化后,其生長擴增能力和殺瘤活性均明顯增強,為淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)的50-100倍。繼Rosenberg首次報道過繼性TILs細胞可有效治療惡性黑色素瘤之后,國內外也開始陸續(xù)開展TILs細胞治療卵巢癌的臨床研究。Aoki等第一次將IL-2活化擴增后的TILs用于晚期或復發(fā)上皮性卵巢的治療。令人欣慰的發(fā)現(xiàn)單獨TILs治療組(7例)中有5例獲得緩解,TILs聯(lián)合化療組(10例)中有9例獲得緩解。Freedman等在1994年納入11例卵巢癌患者行腹腔注射TILs聯(lián)合r1L-2治療,不幸地是,無一例患者獲得臨床緩解。然而,我院張軍一等采用IL-2/TILs治療187例惡性胸腹腔積液患者取得了較好的療效,胸腔積液總有效率為87%,腹腔積液總有效率為58.82%,胸腹腔積液中瘤細胞轉陰率達66.67%,瘤細胞退變或減少率達16.67%。盡管TILs治療卵巢癌的臨床研究甚少,且結果喜憂參半,但TILs細胞能有效治療卵巢癌的理論依據(jù)卻非常充足。首先,卵巢癌細胞表達大量可作為免疫反應靶點的腫瘤相關抗原。其次,大量研究已證實腫瘤組織內TILs細胞的含量,尤其是CD8+T淋巴細胞,與卵巢癌患者預后呈顯著正相關。最后,具有免疫原性的卵巢癌可表達大量能被T淋巴細胞識別的信號肽/MHC復合物。然而,目前制約TILs細胞治療卵巢癌臨床研究進展及治療療效的主要因素涉及TILs細胞制備技術方法不統(tǒng)一、TILs細胞培養(yǎng)時間太長、TILs細胞各成分抗瘤機制不明確、TILs細胞回輸數(shù)量及質量的最佳性、無合理選擇患者的統(tǒng)一標準、聯(lián)合治療應用的最佳選擇等。但考慮到TILs治療卵巢癌的潛在有效性,通過改善分離培養(yǎng)TILs細胞的實驗方法,并深入了解TILs細胞的抗瘤活性及機制可能是提高TILs治療卵巢癌臨床療效的有效方法之一。因此繼續(xù)深入研究TILs細胞的制備方法、生物學特性、抗瘤活性以及治療卵巢癌的有效性仍然是今后的研究方向。目前TILs治療卵巢癌的臨床和基礎研究均很少,且大多數(shù)臨床研究僅限于小樣本非隨機的I期臨床試驗。雖然我院前期臨床觀察研究已發(fā)現(xiàn)腹腔回輸TILs聯(lián)合rIL-2可有效治療腫瘤患者的惡性胸腹水,但并沒有進一步研究TILs的抗瘤機制,以及分析比較TILs聯(lián)合或不聯(lián)合化療治療卵巢癌的有效性。因此為了尋找卵巢癌惡性腹水新的治療模式,本研究擬回顧性分析我院腹腔回輸TILs聯(lián)合或不聯(lián)合化療治療32例卵巢癌惡性腹水患者的臨床療效和毒副作用。同時,通過建立一套從卵巢癌實體瘤組織或腹水中同時高效分離TILs和自體卵巢癌細胞的技術方法,以進一步研究TILs對卵巢癌細胞的體外抗瘤活性機制,從而為今后TILs在卵巢癌中的進一步研究和應用提供更多的依據(jù)。目的(1)回顧性分析腹腔回輸TILs聯(lián)合或不聯(lián)合化療治療卵巢癌惡性腹水的臨床療效和毒副作用,以期尋找治療卵巢癌惡性腹水的最佳治療方法。(2)成功建立一套從卵巢癌組織或腹水中同時高效分離TILs和原代卵巢癌細胞的成熟技術路線。(3)研究TILs經(jīng)體外rIL-2活化擴增前后CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+ TILs細胞亞群比例的變化。(4)研究TILs活化擴增前后對腫瘤細胞特異性和非特異性殺傷活性的變化。(5)研究rIL-2活化擴增后的TILs細胞對自體卵巢癌細胞腫瘤標志物及腹水形成因子分泌的影響。(6)研究rIL-2活化擴增后的TILs細胞對自體卵巢癌細胞凋亡率及凋亡蛋白的影響,以期進一步探討TILs抗腫瘤的生物學機制。研究內容及方法1.臨床部分(1)回顧性收集2001年1月至2011年12月我院32例卵巢癌并發(fā)惡性腹水患者的臨床病理資料。(2)32例卵巢癌惡性腹水患者中,有8例單純接受腹腔回輸TILs治療(TILs組),13例單純接受靜脈化療治療(化療組),11例接受靜脈化療聯(lián)合腹腔回輸TILs治療(聯(lián)合治療組)(3)收集所有患者治療前后的病史資料、體能評分(KPS)、腹水相關癥狀(精神萎靡、食欲不振、失眠、呼吸困難、惡心、嘔吐、腹痛、腹脹、乏力)、血常規(guī)指標、CA125和白蛋白指標。(4)統(tǒng)計分析不同治療方法對卵巢癌惡性腹水患者生活質量的影響,即分析治療前后腹水相關癥狀和KPS的改善情況。(5)比較分析不同治療方法對卵巢癌患者腹水及實體瘤控制率的差異。(6)比較分析三種治療方法對卵巢癌惡性腹水患者生存預后的影響。2.實驗部分(1)無菌收取2014年1月至2014年12月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院14例初診卵巢癌患者的實體瘤組織或腹水。(2)采用聯(lián)合酶消化法、貼壁法、Ficoll不連續(xù)密度梯度離心法等方法分離獲得TILs和自體卵巢癌細胞。(3)流式細胞儀檢測TILs經(jīng)rIL-2活化擴增前后CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+TILs細胞亞群比例的變化。(4)MTT法檢測TILs活化擴增前后對腫瘤細胞的特異性和非特異性殺傷活性變化。(5)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測自體卵巢癌細胞經(jīng)活化擴增TILs處理前后其分子標志物CA125及腹水形成因子MMP-9、VEGF水平的變化。(6)凋亡試劑盒檢測活化擴增后的TILs誘導自體卵巢癌細胞發(fā)生凋亡的情況。(7)免疫組化法檢測活化擴增后的TILs對自體卵巢細胞中凋亡相關蛋白Caspase3表達的影響。研究結果1.臨床結果(1)卵巢癌惡性腹水患者的臨床特征32例卵巢癌惡性腹水患者的中位年齡為56歲。所有患者中漿液性腺癌21例,FIGO分期Ⅱ期1例,Ⅲ-IV期共有31例。腹水細胞學陽性27例,陰性5例。三組患者之間的年齡、臨床分期、減瘤滿意度、病理類型、組織學分級、腹水細胞學涂片和腹水深度之間均無統(tǒng)計學差異(P0.05)。(2)腹腔回輸TILs細胞的基本特征TILs治療組中,TILs的平均培養(yǎng)時間為10.3±2.8天,腹腔注射TILs的總數(shù)量范圍為9×109到39×109個(24.3±±11.4 x109)。聯(lián)合治療組中,TILs的平均培養(yǎng)時間為10.5±3.6天,腹腔注射TILs的總數(shù)量范圍為3×109到54×109個(25.2±17.0×109)。TILs培養(yǎng)時間和TILs回輸劑量在兩組患者之間無統(tǒng)計學差異。(3)不同治療方法對卵巢癌患者生活質量的影響與治療前相比,32例患者的生活質量在治療后均得到了明顯的改善,KPS評分(均數(shù)±標準差)由62.2±10.4升高至74.4±13.7,腹水相關癥狀評分由1.4±0.6降至0.6±0.7,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.001)。TILs組卵巢癌患者的KPS、腹水相關癥狀和白蛋白在治療前后均無明顯差異�；熃M患者中僅KPS、腹脹、厭食和乏力癥狀得到了顯著地改善。聯(lián)合治療組中,除呼吸困難、惡心和嘔吐癥狀無顯著改善以外,余腹水相關癥狀、KPS和白蛋白均獲得了顯著地改善(P0.05)。(4)不同治療方法的療效評價聯(lián)合治療組患者的腹水客觀緩解率為90.9%,顯著高于TILs組(37.5%,P=0.009)和化療組(53.8%,P=0.047)。同時聯(lián)合治療組的腫瘤客觀緩解率(63.6%)也顯著高于TILs治療組(25%,P=0.002),但與化療組(30.8%)之間無統(tǒng)計學差異�；熤委熃M和聯(lián)合治療組分別有8例和4例患者出現(xiàn)了可控的I-III度化療相關不良反應,主要為骨髓抑制和惡心嘔吐。無腹腔注射TILs相關并發(fā)癥的發(fā)生。(5)不同治療方法對卵巢癌惡性腹水患者預后的影響與聯(lián)合治療組(13個月)相比,TILs治療組(1個月,P0.001)和化療(6個月,P＝0.027)的中位無進展生存時間明顯縮短。同時聯(lián)合治療組患者的中位總生存時間(25個月)也明顯長于TILs治療組(7個月,P0.001),但與單純化療組(18個月)相比無統(tǒng)計學差異。2.實驗結果(1)成功制定出一套同時高效分離TILs和自體卵巢癌細胞的技術方法木實驗分別采用低成本的聯(lián)合酶(膠原酶、透明質酸酶、DNA酶)消化法、過濾法、半小時貼壁法、Ficoll不連續(xù)密度梯度離心法、rIL-2活化擴增法等從卵巢癌實體瘤組織或腹水中同時高效分離出TILs和自體卵巢癌細胞。(2) TILs和原代卵巢癌細胞的生長情況成功分離14例卵巢癌患者的TILs和卵巢癌細胞。初分離的TILs呈圓形,懸浮生長,隨著培養(yǎng)時間延長,細胞可呈圓形、分支狀、桿狀,生長旺盛期可見細胞呈集落樣生長。原代卵巢癌細胞生長較緩慢,形態(tài)多為圓形、類圓形、不規(guī)則多邊形,大部分成團、成堆生長。(3) TILs活化擴增前后免疫細胞亞群的變化與初分離的TILs相比,TILs經(jīng)rIL-2活化擴增第14天的CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+TILs細胞亞群均明顯增加。CD3+TILs由46.31±15.53%增加至85.544±5.54%(P0.001),CD8+/CD3+TILs由16.31+7.49%增加至42.32±14.01%(P9.001), CD4+/CD3+TILs由18.59±13.06%增加至31.88±10.99%(P=0.007),差異均具有統(tǒng)計學意義。經(jīng)r1L-2活化擴增后,CD8+/CD3+TILs細胞亞群比例明顯高于CD4+/CD3+TILs細胞比例(P=0.037)。(4)經(jīng)r1L-2活化擴增后的TILs對腫瘤細胞顯示了良好的殺傷活性初分離TILs對自體卵巢癌細胞、K562和Raji細胞的特異性和非特異性殺傷力均很低。經(jīng)rIL-2活化擴增14天后,TILs細胞的特異性和非特異性殺傷活性均明顯增強,對自體卵巢癌細胞的殺傷活性(54.60±11.20%)明顯高于K562細胞(23.42±6.92%)和Raji細胞(19.68±5.73%),差異均具有統(tǒng)計學意義(P0.001)(5)活化擴增后的TILs可有效抑制自體卵巢癌細胞分子標志物的分泌活化擴增14天后的TILs可顯著抑制自體卵巢癌細胞腫瘤標志物和腹水形成因子的分泌。卵巢癌細胞經(jīng)TILs處理后,其培養(yǎng)上清液中的CA125、VEGF、 MMP-9;水平均有明顯地下降,CA125由377.21±258.44 U/ml降至165.05±132.82U/ml(P0.001),VEGF由247.22±226.69 pg/ml降至100.22±98.26 pg/ml (P=0.003), MMP-9由211.00±156.59 pg/ml降至64.23±57.63 pg/ml (P0.001),差異均具有統(tǒng)計學意義。(6)經(jīng)rIL-2活化擴增后的TILs可誘導自體卵巢癌細胞發(fā)生凋亡TIL經(jīng)rIL-2活化擴增14天后對自體卵巢癌細胞的致凋亡作用明顯增強。與對照組(4.21±4.14%)相比,處理組卵巢癌細胞的凋亡率高達24.49±17.29%(P0.001)。同時凋亡相關蛋白Caspase3的表達評分由殺傷前的1.57±1.40增加至殺傷后的5.21±3.70(P=0.001),陽性率由14.3%(2/14)增加至57.1%(8/14),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.018)結論1. TILs可在一定程度上改善不能或不愿接受化療治療的晚期卵巢癌惡性腹水患者的生活質量,甚至可以改善部分患者的預后。2.和單純化療相比,過繼性TILs細胞聯(lián)合化療治療卵巢癌惡性腹水不僅安全、低毒,而且在有效控制腹水的同時可以顯著改善患者的生活質量。3.本實驗室成功制定出一套從卵巢癌組織或腹水中同時高效分離TILs和原代卵巢癌細胞的技術路線。4. TILs經(jīng)體外rIL-2活化擴增2周內均可達臨床上的有效治療劑量(x109個)。5.經(jīng)rIL-2活化擴增后,CD3+、CD8+/CD3+和CD4+/CD3+TILs細胞亞群均明顯增加。6.活化擴增后的TILs對腫瘤細胞具有良好的特異性性殺傷活性。7.活化擴增后的TILs可顯著抑制卵巢癌細腹水形成囚子VEGF、MMP-9的合成和分泌,這可能是TILs能有效控制卵巢癌惡性腹水的原因之一。8. TILs細胞可能通過Caspase3途徑誘導自體卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。9.因此充分利用手術切除瘤組織或腹水中的TILs可成為改善卵巢癌預后的有效方法之。
【關鍵詞】：卵巢癌 腫瘤浸潤淋巴細胞 腹水 預后 抗瘤活性
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-23
• 前言23-30
• 第一章 腫瘤浸潤淋巴細胞在卵巢癌中的臨床研究30-39
• 1.1 材料與方法30-32
• 1.2 結果32-38
• 1.3 結論38-39
• 第二章 腫瘤浸潤淋巴細胞在卵巢癌中的基礎研究39-64
• 2.1 材料與方法39-55
• 2.2 結果55-63
• 2.3 結論63-64
• 討論64-70
• 全文小結70-71
• 參考文獻71-79
• 中英文縮略詞表79-80
• 攻讀碩士學位期間成果80-81
• 致謝81-82

【共引文獻】

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本文編號：736529