本文關(guān)鍵詞：高危人乳頭瘤病毒16型、18型E6蛋白重組表達及單克隆抗體制備

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【摘要】：宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性患者中第二多發(fā)的癌癥,具有較高的致病率和致死率。女性宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是因為長期受到高風險性人乳頭瘤病毒(HPV)感染。人乳頭瘤病毒是最廣泛的性傳播病毒,有超過100種HPV病毒變種。在世界范圍內(nèi),引起宮頸癌最多的是16型、18型兩種,占到70%以上。而另外常見的兩種低風險性的6型、11型則會引起男性生殖器疣。HPV是無外殼的dsDNA病毒,基因組為環(huán)狀,大約有8000 bp。編碼8種蛋白,其中6個早期蛋白,2個晚期蛋白。從HPV感染宮頸鱗狀上皮細胞開始,到病毒持續(xù)存在上皮細胞,并使宿主細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞的過程中,E6蛋白扮演著至關(guān)重要的角色。在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)各個分期中,E6蛋白均有表達,并隨著病程發(fā)展,逐漸增多。研究表明,E6蛋白在CIN Ⅰ期,CINⅡ期,CINⅢ期中的陽性率分別為75%、88.25%、100%。因此,針對16、18型E6基因及其基因產(chǎn)物的檢測是早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌和作為宮頸癌病程發(fā)展的重要指標。目前市場上檢測HPV的方法主要有分子生物學(xué)方法,包括核酸雜交方法、基于信號放大的分析方法如Digene公司的HC2試劑盒、核酸擴增方法。核酸雜交的方法缺點是靈敏度低、需要大量純度高的DNA樣本、程序耗時長,不可以分型。而基于核酸擴增的方法樣本要求少,可以分型,靈敏度高,但是由于HPV具有一過性感染的特性,檢測結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性,并且由于需要擴增過程,從而導(dǎo)致對檢測環(huán)境要求較高,檢測時間較長,檢測成本較高。而針對HPV16型、18型E6蛋白的檢測不僅靈敏度高,成本低,重復(fù)性好,還能反應(yīng)病毒的真實活動情況,并且可以為臨床子宮頸病變診斷分期提供幫助。本研究首先利用設(shè)計的針高危HPV16型、18型病毒的特異性引物從宮頸癌病變組織中提取HPV的基因組DNA中擴增出16型、18型E6蛋白基因；然后通過分子克隆的方法,將E6蛋白基因構(gòu)建到表達載體PET28a和PET32a上,轉(zhuǎn)入宿主菌BL21(DE3)中,進行原核表達；隨后利用鎳柱純化HPV16型E6蛋白和HPV18型E6蛋白并復(fù)性；最后將得到的純化的蛋白免疫Babl/c小鼠。通過血清效價檢測,選擇高效價的經(jīng)PET28a-HPV16 E6和 PET28a-HPV18 E6兩種蛋白免疫的小鼠,通過細胞融合、篩選及克隆化工作,制備相應(yīng)的單克隆抗體。最終篩選到特異性針對HPV18E6的細胞株HPV18E6/3-7D,能夠特異性針對HPV18E6重組蛋白的單克隆抗體,經(jīng)過特異性實驗分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該抗體不與HPV16E6蛋白、表達系統(tǒng)蛋白、HepG2細胞蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。本研究制備了特異性針對HPV18E6蛋白的單克隆抗體,下一步可以用臨床病人樣本對該單抗進一步驗證,并結(jié)合化學(xué)發(fā)光或納米技術(shù)開發(fā)新型免疫檢測分析方法。
【關(guān)鍵詞】：人乳頭瘤病毒16型 人乳頭瘤病毒18型 E6蛋白 重組表達 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 英文縮略詞表5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 綜述11-22
• 1.1 人乳頭瘤病毒概述11-16
• 1.1.1 HPV感染與宮頸癌關(guān)系12-13
• 1.1.2 HPV基因結(jié)構(gòu)及功能13-14
• 1.1.3 HPV早期蛋白E6/E7的功能及其分子機制14-16
• 1.2 人乳頭瘤病毒檢測方法16-20
• 1.2.1 病理、細胞學(xué)、組化檢查16
• 1.2.2 分子生物學(xué)方法檢測HPV16-19
• 1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)檢測HPV19-20
• 1.3 研究目的和內(nèi)容20-22
• 1.3.1 人乳頭瘤病毒16型、18型E6蛋白重組質(zhì)粒構(gòu)建20
• 1.3.2 人乳頭瘤病毒16型、18型E6蛋白原核表達及純化20
• 1.3.3 人乳頭瘤病毒18型E6蛋白單克隆抗體制備及鑒定20-22
• 第二章 HPV16型、18型E6蛋白重組質(zhì)粒構(gòu)建22-29
• 2.1 實驗材料及方法22-26
• 2.2 實驗結(jié)果26-28
• 2.2.1 PCR擴增HPV 16型、HPV 18型E6蛋白基因26
• 2.2.2 陽性克隆的篩選26-28
• 2.3 討論28-29
• 第三章 HPV16型、18型E6蛋白原核表達及純化29-46
• 3.1 實驗材料及方法29-35
• 3.2 實驗結(jié)果35-43
• 3.2.1 PET28a-16E6、PET28a-18E6蛋白表達35-36
• 3.2.2 IPTG濃度對PET28a-18E6表達影響36-37
• 3.2.3 時間對PET28a-18E6表達影響37
• 3.2.4 溫度對PET28a-18E6表達影響37-38
• 3.2.5 PET28a-16E6蛋白、PET28a-18E6蛋白純化38-39
• 3.2.6 Western blotting分析PET28a-16E6蛋白、PET28a-18E6蛋白表達39
• 3.2.7 IPTG濃度對PET32a-18E6表達影響39-40
• 3.2.8 時間對PET32a-18E6表達影響40
• 3.2.9 溫度對PET32a-18E6表達影響40-41
• 3.2.10 Western blotting分析PET32a-16E6蛋白、PET32a-18E6蛋白表達41-42
• 3.2.11 包涵體蛋白復(fù)性42-43
• 3.3 討論43-46
• 第四章 HPV16型、18型E6蛋白單克隆抗體制備及鑒定46-57
• 4.1 實驗材料及方法47-52
• 4.2 實驗結(jié)果52-56
• 4.2.1 小鼠血清效價測定52-53
• 4.2.2 單克隆篩選及克隆化53-54
• 4.2.3 Western blotting鑒定單克隆抗體特異性54
• 4.2.4 ELISA驗證抗體特異性54-56
• 4.3 討論56-57
• 參考文獻57-63
• 附錄63-65
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章和成果65-66
• 致謝66-67

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉昱,婁之聰,佟振清,孫文穎;創(chuàng)傷誘發(fā)大鼠脊髓Fos樣蛋白免疫反應(yīng)特征[J];針刺研究;1994年Z1期

2 張津利;重組雜交蛋白免疫夜猴對瘧疾感染的保護作用[J];國外醫(yī)學(xué)(寄生蟲病分冊);1993年03期

3 廖法學(xué);彭麗娜;張平平;楊帆;劉慧敏;陳偉;梁坤;張玉俠;沈際佳;;EBI3蛋白基因克隆、表達及其初步鑒定[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2010年01期

4 胡雪梅,張兆松,蘇川,吳海瑋,季e鹲，

本文編號：735344