本文關(guān)鍵詞：線粒體基因ND1和ND3在結(jié)直腸癌中的調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：線粒體是細(xì)胞有氧呼吸的主要場所,其氧化磷酸化產(chǎn)物ATP是生命活動的主要能量來源。近年來的文獻(xiàn)報道提示線粒體基因ND1、ND3在結(jié)直腸癌的癌組織和癌旁組織中存一定的刪缺概率。ND1和ND3蛋白亞基作為呼吸鏈中復(fù)合物Ⅰ的重要組成部分,參與氧化磷酸化產(chǎn)能的關(guān)鍵步驟。呼吸鏈上基因異常導(dǎo)致的細(xì)胞能量代謝紊亂是癌癥發(fā)病的誘因之一。這強(qiáng)烈預(yù)示著線粒體基因ND1、D3可能參與結(jié)直腸癌調(diào)控,但其具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。本研究分別在細(xì)胞水平和組織水平對比了人結(jié)直腸癌細(xì)胞和正常腸上皮細(xì)胞,人結(jié)直腸癌組織和癌旁組織,發(fā)現(xiàn)了ND1和ND3基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的差異。并在5株結(jié)直腸癌細(xì)胞中遴選出了HT29和HCT116作為主要研究對象,使用SiRNA干擾的方式在HT29和HCT16中對NDl和ND3基因進(jìn)行了干擾下調(diào)實驗,MTS實驗結(jié)果顯示下調(diào)ND1或ND3后細(xì)胞增殖活力均有下降。Western Blot結(jié)果顯示調(diào)節(jié)ND1對PGC1a具有下調(diào),對COXⅣ蛋白的表達(dá)具有上調(diào)作用,ND3對PGCla和COXIV蛋白的表達(dá)具有下調(diào)作用,且ND1和ND3的蛋白表達(dá)量之間也存在相互影響。應(yīng)用BrdU和PI染色結(jié)合流式檢測結(jié)果顯示Si干擾ND1和ND3后的細(xì)胞較NC組在第20至24小時之間有增殖滯后現(xiàn)象,同時干擾ND1和ND3后G0/G1期細(xì)胞增加,增殖周期明顯滯后。而且下調(diào)ND1和ND3基因后檢測到ATP下降,ROS降低,COX Ⅰ的活性也相應(yīng)降低。上述研究表明,在HT29和HCT116細(xì)胞中下調(diào)ND1、ND3基因后細(xì)胞的增殖活性均受到一定抑制,細(xì)胞增殖周期干擾后有滯后現(xiàn)象。同時ATP、ROS、復(fù)合物Ⅰ以及能量代謝相關(guān)基因VDAC、PGCla、COX4的蛋白表達(dá)量也發(fā)生了相關(guān)變化,這對進(jìn)一步了解結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制及治療方法提供了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：線粒體 結(jié)直腸癌 ND1 ND3 BrdU
【學(xué)位授予單位】：云南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略詞對照表7-12
• 第一章 前言12-22
• 1 線粒體介紹12-14
• 1.1 線粒體的發(fā)現(xiàn)歷史12
• 1.2 線粒體基因結(jié)構(gòu)12-13
• 1.3 線粒體生理功能及相關(guān)研究13-14
• 2. 線粒體基因與能量代謝14-17
• 2.1 線粒體氧化呼吸鏈14-16
• 2.2. 線粒體功能與腫瘤16
• 2.3 線粒體基因ND1、ND3的結(jié)構(gòu)與功能16-17
• 3.17-18
• 3.1 結(jié)直腸癌研究現(xiàn)狀17
• 3.2 結(jié)直腸癌檢測方法17-18
• 3.3 結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)基因18
• 4. RNAi干擾技術(shù)及BrdU標(biāo)記方法18-21
• 4.1 RNAi的作用機(jī)制18-20
• 4.2 BrdU摻入標(biāo)記20-21
• 5. 研究的目的及意義21-22
• 第二章. 材料與方法22-41
• 1 實驗材料22-25
• 1.1 細(xì)胞株22-23
• 1.2 主要試劑耗材23-24
• 1.3 主要儀器24-25
• 2. 組織水平檢測實驗方法25-32
• 2.1 結(jié)直腸癌病理組織水平ND1、ND3基因差異性檢測實驗25-26
• 2.2 熒光定量PCR檢測病理組織中MT-ND1、MT-ND3表達(dá)情況26-28
• 2.3 Western Blot檢測組織水平中ND1、ND3表達(dá)差異28-32
• 3 細(xì)胞水平檢測實驗方法32-35
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)32-33
• 3.2 細(xì)胞鋪板33
• 3.3 PCR擴(kuò)增mtND1、mtND3的全長目的基因序列33-34
• 3.4 實時熒光定量PCR檢測6株細(xì)胞ND1、ND3表達(dá)情況34-35
• 3.5 Western Blot檢測六株細(xì)胞中ND1、ND3的蛋白表達(dá)量35
• 4. HT29、HCT116細(xì)胞株ND1/ND3干擾下調(diào)后相關(guān)項目檢測實驗35-41
• 4.1 HT29、HCT116細(xì)胞株SiND1/SiND3干擾片段篩選實驗36-37
• 4.2 轉(zhuǎn)染效率檢測37
• 4.3 RT-PCR檢測并篩選干擾片段干擾效率37
• 4.4 Weasten Bolt檢測干擾并篩選干擾片段效率37-38
• 4.5 ND1 ND3基因下調(diào)對HT29、HCT116細(xì)胞增殖活性的影響38
• 4.6 流式檢測細(xì)胞周期38-39
• 4.7 BrdU摻入聯(lián)合PI染色監(jiān)測細(xì)胞增殖周期39
• 4.8 細(xì)胞ATP檢測實驗39-40
• 4.9 ROS檢測40
• 4.10 線粒體復(fù)合物Ⅰ活性檢測40-41
• 第三章. 結(jié)果與分析41-65
• 1. 結(jié)直腸癌病理組織ND1、ND3基因差異檢測結(jié)果41-44
• 1.1 CRC病理組織中ND1、ND3全長片段PCR對比結(jié)果42
• 1.2 CRC病理組織中ND1、ND3定量Q-PCR檢測結(jié)果42-43
• 1.3 CRC病理組織中ND1、ND3蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果43-44
• 2. 結(jié)直腸癌細(xì)胞株差異性檢測結(jié)果44-46
• 2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞株基因組ND1、ND3全長片段PCR對比結(jié)果44
• 2.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞株ND1、ND3定量qRT-PCR檢測結(jié)果44-45
• 2.3 結(jié)直腸癌細(xì)胞ND1、ND3蛋白表達(dá)量檢測結(jié)果45-46
• 3. HT29、HCT116細(xì)胞株ND1、ND3 SiRNA干擾篩選結(jié)果46-51
• 3.1 SiRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果47-49
• 3.2 干擾效率檢測49-51
• 4. 下調(diào)ND1基因和ND3基因后細(xì)胞水平相關(guān)檢測結(jié)果51-65
• 4.1 下調(diào)ND1后HT29、HCT116細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果52
• 4.2 下調(diào)ND3后HT29、HCT116細(xì)胞增殖活力檢測結(jié)果52-53
• 4.3 細(xì)胞周期檢測結(jié)果53-56
• 4.4 下調(diào)ND1、ND3后BRDU&PI雙染監(jiān)測細(xì)胞增殖周期結(jié)果56-60
• 4.5 下調(diào)ND1、ND3后細(xì)胞ATP含量變化檢測結(jié)果60-61
• 4.6 下調(diào)ND1、ND3后細(xì)胞ROS含量變化檢測結(jié)果61-62
• 4.7 下調(diào)ND1、ND3后細(xì)胞線粒體復(fù)合物Ⅰ活性變化檢測結(jié)果62-64
• 4.8 下調(diào)ND1、ND3基因后對細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響64-65
• 第四章. 討論65-67
• 1. 線粒體基因差異表達(dá)65
• 2. 線粒體基因ND1和ND3與細(xì)胞增殖的關(guān)系65-66
• 3. BrdU聯(lián)合P1分析細(xì)胞增殖速率66-67
• 第五章. 結(jié)論67-68
• 附錄一 相關(guān)試劑配制方法68-70
• 附錄二 SiRNA序列70-72
• 參考文獻(xiàn)72-80
• 碩士期間科研成果及參與項目情況80-82
• 致謝82

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本文編號：734212