本文關(guān)鍵詞：白念珠菌誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞（THP-1細(xì)胞）固有免疫應(yīng)答機(jī)制的初步研究

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【摘要】：第一章人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)吞噬作用研究目的研究人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)對(duì)墨汁、白念珠菌的吞噬情況,初步探討肌動(dòng)蛋白在吞噬過程中的作用。方法以丙二醇甲醚醋酸酯(Propylene glycol monomethyl ether acetate,PMA)誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞為巨噬細(xì)胞,分別以適量墨汁、滅活的白念珠菌菌懸液與其進(jìn)行共培養(yǎng),觀察THP-1細(xì)胞吞噬情況。并以細(xì)胞松弛素-B(Cytochalasin-B,Cyt-B)對(duì)THP-1細(xì)胞預(yù)處理后,觀察細(xì)胞對(duì)白念珠菌吞噬情況。結(jié)果經(jīng)PMA誘導(dǎo)后的THP-1細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,出現(xiàn)胞對(duì)培養(yǎng)瓶的附著,并有多形性的細(xì)胞形狀。與墨汁、白念珠菌共培養(yǎng)后可見細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量墨汁、白念珠菌成分。經(jīng)Cyt-B預(yù)處理后的細(xì)胞不能吞噬白念珠菌,僅可見少量白念珠菌與細(xì)胞黏附。結(jié)論THP-1細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞后具有吞噬功能,白念珠菌可被誘導(dǎo)后的THP-1細(xì)胞吞噬；吞噬過程的發(fā)生依賴肌動(dòng)蛋白的聚集。第二章白念珠菌誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)產(chǎn)生前炎癥因子的初步研究目的研究白念珠菌對(duì)THP-1細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等前炎癥因子的影響。方法實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析不同濃度(105 CFU/ml.106 CFU/ml)滅活白念珠菌。脂多糖(LPS)刺激THP-1細(xì)胞后TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)水平變化；并以酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)THP-1細(xì)胞與106 CFU/ml滅活白念珠菌、LPS共培養(yǎng)后TNF-α、IL-6的分泌量。結(jié)果105 CFU/ml白念珠菌組、106 CFU/ml白念珠菌組、陽性刺激物脂多糖(LPS)刺激THP-1細(xì)胞組以及空白對(duì)照組的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)水平進(jìn)行雙因素方差分析,結(jié)果顯示不同組別的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)水平有差異(F=110.983,P0.001；F=294.114,P0.001)；刺激1、3、6h之間也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=701.680,P0.001;F=1036.557,P0.001) ;提示在6h內(nèi)白念珠菌上調(diào)TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平隨時(shí)間延長而增高,且白念珠菌組上調(diào)TNF-α mRNA、IL-6 mRNA水平表現(xiàn)為劑量依賴效應(yīng)。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h,白念珠菌組、LPS組、培養(yǎng)基對(duì)照組的上清液中TNF-α蛋白濃度分別為(6385.70±533.99)ng/L、(3212.06±353.00)ng/L、(147.10±0.53)ng/L,三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,F=71.25,P0.01),白念珠菌組、LPS組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較,TNF-α蛋白分泌量均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.01、0.05)。106 CFU/ml白念珠菌刺激后24 h,白念珠菌組、LPS組、培養(yǎng)基對(duì)照組的上清液中IL-6蛋白濃度分別為(924.90±30.13)ng/L、(286.10±6.12)ng/L、(10.47±0.07)ng/L,三者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=8,F=61.27,P0.01),白念珠菌組、LPS組分別與培養(yǎng)基對(duì)照組比較,IL-6蛋白分泌量均明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.01、0.01)。結(jié)論THP-1細(xì)胞體外與白念珠菌作用后分泌TNF-α、IL-6水平明顯增高,且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)與時(shí)間依賴效應(yīng),從而參與抗念珠菌感染固有免疫反應(yīng)。第三章白念珠菌誘導(dǎo)活化人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)信號(hào)通路的初步研究目的探討白念珠菌對(duì)THP-1細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核因子κB (NF-κB)激活的影響。方法免疫印跡法分析106 CFU/ml滅活白念珠菌體外作用THP-1細(xì)胞30min、1h后p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平及IκBα和磷酸化IκBα的水平。以106 CFU/ml滅活白念珠菌菌懸液、LPS刺激THP-1細(xì)胞后,以免疫熒光法觀察NF-κB核轉(zhuǎn)位。同時(shí)設(shè)置地塞米松抑制組,以同樣的方法檢測(cè)p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平；并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)地塞米松預(yù)處理后THP-1細(xì)胞TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)水平的變化。結(jié)果106 CFU/ml白念珠菌作用于THP-1細(xì)胞30min、60 min后磷酸化p38MAPK、磷酸化IKBa蛋白水平明顯升高。培養(yǎng)基對(duì)照組中,p65處于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；白念珠菌及LPS誘導(dǎo)刺激后,核內(nèi)出現(xiàn)p65。地塞米松抑制組可降低白念珠菌對(duì)磷酸化P38MAPK的激活水平。40 gg/L地塞米松預(yù)先與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)30 min后,再以106 CFU/ml白念珠菌刺激6 h檢測(cè)TNF-α mRNA表達(dá)水平(3.77±0.62)較未用地塞米松組(208.50±10.50)明顯降低,IL-6 mRNA表達(dá)水平(12.66±1.63)較未用地塞米松組(584.43±16.80)明顯降低。地塞米松可阻斷白念珠菌上調(diào)TNF-α mRNA、IL-6 mRNA表達(dá)水平。結(jié)論THP-1細(xì)胞體外與白念珠菌作用后可激活信號(hào)分子p38MAPK、NF-κB,并分泌TNF-α、IL-6等前炎癥因子,參與抗念珠菌感染固有免疫反應(yīng)。第四章白念珠菌誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)C型凝集素-I受體(Dectin-1)表達(dá)的初步研究目的探討白念珠菌刺激THP-1細(xì)胞后能否引起Dectin-1受體表達(dá)量發(fā)生變化。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1細(xì)胞經(jīng)不同時(shí)間點(diǎn)滅活白念珠菌菌懸液、Curdlan(一種p-葡聚糖)刺激后Dectin-1受體的表達(dá)水平。結(jié)果白念珠菌、Curdlan刺激THP-1細(xì)胞3h后,Dectin-1受體表達(dá)量較對(duì)照組無明顯變化,自6h起其表達(dá)量逐漸升高,6h組、12h組、24h組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);且白念珠菌上調(diào)Dectin-1受體表達(dá)水平呈時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系,隨著刺激時(shí)間的延長,表達(dá)量逐漸升高,至24h仍處于較高水平。結(jié)論THP-1細(xì)胞體外與白念珠菌作用后可促使Dectin-1受體表達(dá)量增高。THP-1細(xì)胞可能通過增高Dectin-1受體的表達(dá)水平,并活化下游信號(hào)分子通路,從而發(fā)揮抗白念珠菌的固有免疫反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：白念珠菌 單核巨噬細(xì)胞 腫瘤壞死因子α 白細(xì)胞介素6 p38絲裂原活化蛋白激酶 核因子κB C型凝集素-1受體
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R733.7
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• Abstract9-12
• 前言12-16
• 參考文獻(xiàn)14-16
• 第一章 人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)吞噬作用的初步研究16-26
• 引言16
• 材料和方法16-19
• 結(jié)果19-22
• 討論22-23
• 參考文獻(xiàn)23-26
• 第二章 白念珠菌誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)產(chǎn)生前炎癥因子的初步研究26-36
• 引言26
• 材料和方法26-30
• 結(jié)果30-32
• 討論32-34
• 參考文獻(xiàn)34-36
• 第三章 白念珠菌誘導(dǎo)活化人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)信號(hào)通路的初步研究36-48
• 引言36
• 材料和方法36-40
• 結(jié)果40-44
• 討論44-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 第四章 白念珠菌誘導(dǎo)人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1細(xì)胞)C型凝集素-1受體表達(dá)的初步研究48-56
• 前言48
• 材料和方法48-50
• 結(jié)果50-53
• 討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-56
• 全文小結(jié)56-58
• 論文相關(guān)綜述58-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 在讀期間發(fā)表文章66-68
• 致謝68-70

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