本文關(guān)鍵詞：SFRP5在胰腺癌中的表達(dá)意義及其shRNA慢病毒載體的構(gòu)建

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【摘要】：目的:探討SFRP5基因在胰腺癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系,設(shè)計和構(gòu)建人SFRP5-sh RNA慢病毒載體,并進(jìn)行鑒定和包裝,為下一步探索SFRP5在胰腺癌細(xì)胞系中的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)材料。方法:收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外科2010年至2013年間的胰腺癌石蠟包埋切塊。選擇病理診斷明確、病理和隨訪資料完整的71例標(biāo)本,采用免疫組化方法,檢測SFRP5在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況,并分析SFRP5的表達(dá)情況與臨床病理因素及患者預(yù)后的關(guān)系;利用Western-bloting和q RT-PCR方法,提取新鮮組織中的蛋白和m RNA,檢測SFRP5蛋白和SFRP5 m RNA在胰腺癌新鮮組織中的表達(dá)情況。根據(jù)Gen Bank上公布的人SFRP5基因信息,構(gòu)建SFRP-sh RNA慢病毒干擾載體,通過293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,并測定病毒滴度。結(jié)果:SFRP5蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(40.8%vs85.7%,P0.05),SFRP5蛋白表達(dá)與胰腺癌患者的TNM分期(P0.05)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P0.05)、胰周侵犯(P0.05)及預(yù)后具有相關(guān)性,并且是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。成功構(gòu)建SFRP5-sh RNA慢病毒載體,轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后在熒光顯微鏡下可見綠色熒光,并進(jìn)行病毒包裝,純化出慢病毒顆粒,測得其滴度1*109 TU/ml。結(jié)論:SFRP5蛋白在胰腺癌中表達(dá)消失,是影響胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素,SFRP5低表達(dá)、存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期晚及存在胰周侵犯的患者預(yù)后較差。通過RNA干擾技術(shù),成功構(gòu)建人SFRP5-sh RNA慢病毒載體,包裝后獲得較高的病毒滴度,其感染的胰腺癌細(xì)胞系將為后續(xù)的胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：SFRP5 胰腺癌 慢病毒
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-5
• 中英文對照表5-8
• 前言8-11
• 第一部分 SFRP5在胰腺癌中的表達(dá)意義11-34
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料11-13
• 1.1.1 組織標(biāo)本11-12
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及耗材12
• 1.1.3 主要儀器12-13
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法13-20
• 1.2.1 主要試劑的配制13-14
• 1.2.2 Western-Blot法檢測胰腺癌及癌旁組織中SFRP5蛋白的表達(dá)14-16
• 1.2.3 q RT-PCR法檢測胰腺癌及癌旁組織中SFRP5 m RNA的表達(dá)16-18
• 1.2.4 免疫組織化學(xué)法檢測胰腺癌組織中SFRP5蛋白的表達(dá)18-19
• 1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法19-20
• 1.3 結(jié)果20-30
• 1.3.1 胰腺癌及癌旁組織中SFRP5蛋白的表達(dá)20-21
• 1.3.2 胰腺癌及癌旁組織中SFRP5 m RNA的表達(dá)21
• 1.3.3 免疫組化分析結(jié)果21-23
• 1.3.4 SFRP5蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系23-24
• 1.3.5 SFRP5蛋白表達(dá)與胰腺癌預(yù)后的關(guān)系24-30
• 1.4 討論30-33
• 1.5 小結(jié)33-34
• 第二部分 SFRP5-sh RNA慢病毒載體的構(gòu)建34-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料34-35
• 2.1.1 慢病毒載體信息34-35
• 2.1.2 試劑35
• 2.1.3 儀器35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-40
• 2.2.1 sh RNA靶點(diǎn)的選擇35-36
• 2.2.2 sh RNA引物的設(shè)計36
• 2.2.3 RNAi慢病毒重組質(zhì)粒的構(gòu)建36-37
• 2.2.4 慢病毒包裝37-39
• 2.2.5 Lentivirus滴度測定39-40
• 2.3 結(jié)果40-45
• 2.3.1 SFRP5基因信息40-41
• 2.3.2 SFRP5 si RNA基因序列41
• 2.3.3 SFRP5-sh RNA載體質(zhì)粒圖譜41-42
• 2.3.4 SFRP5-sh RNA慢病毒載體質(zhì)粒測序42-43
• 2.3.5 慢病毒共轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞43-44
• 2.3.6 慢病毒滴度測定44-45
• 2.4 討論45-46
• 2.5 小結(jié)46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 在學(xué)期間研究成果52-53
• 綜述53-60
• 參考文獻(xiàn)57-60
• 致謝60

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4 記者 朱弼瑜　專業(yè)指導(dǎo) 劉玉坦 新安國際醫(yī)院普通外科副主任醫(yī)師 董波 嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)學(xué)科負(fù)責(zé)人、公共營養(yǎng)師;健康生活,遠(yuǎn)離“癌癥之王”[N];嘉興日報;2011年

5 保健時報記者 王朝建 通訊員 王懿輝;中年突發(fā)糖尿病當(dāng)心胰腺癌[N];保健時報;2012年

6 上海市腫瘤醫(yī)院胰腺肝膽外科主任醫(yī)師 虞先o，

本文編號：729119