本文關(guān)鍵詞：腹腔巨噬細胞亞型對上皮性卵巢癌惡性表型的影響

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【摘要】：目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)腫瘤中死亡率最高的疾病,初診者中70%的病例已屬晚期,病變多已累及盆腹腔內(nèi)的許多臟器,如大網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)移,肝臟的轉(zhuǎn)移或腸系膜根部的轉(zhuǎn)移等,晚期卵巢癌以腹腔廣泛種植播散和大量腹水為主要臨床特征。人正常腹腔微環(huán)境中存在大量免疫細胞尤其是巨噬細胞,巨噬細胞作為固有免疫的主要細胞成分對維持腹腔正常免疫環(huán)境有非常重要的作用。在卵巢癌腹腔種植播散的過程中,巨噬細胞與腫瘤細胞存在一定的相互作用,從而影響腫瘤細胞的惡性表型和不良轉(zhuǎn)歸。本課題擬通過檢測不同分期卵巢癌患者腹腔巨噬細胞亞型,構(gòu)架腹腔巨噬細胞體外模型,探討腹腔巨噬細胞對卵巢癌的影響,來描述不同腹腔巨噬細胞亞型對卵巢癌惡性表型的不同影響,闡述卵巢癌腹腔播散和轉(zhuǎn)移的免疫機制,為腹腔免疫微環(huán)境對卵巢癌的影響提供理論參考,為卵巢癌免疫治療提供新的分子靶點和治療思路,為解釋卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展提供新的線索,并為基于卵巢癌免疫治療的干預(yù)策略提供理論基礎(chǔ)。方法:1 用CD68、CD64、CD163分別標記巨噬細胞(M0)、M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞,觀察10例卵巢癌患者及17例卵巢良性腫瘤患者的腹水或腹腔沖洗液中M2/M1的比值。2 Ficoll密度梯度法分離健康成人外周血單個核細胞,GM-CSF誘導(dǎo)為巨噬細胞(M0),用對數(shù)生長期的SKOV3細胞培養(yǎng)上清液處理為實驗組,用1640培養(yǎng)基處理為對照組,分別于培養(yǎng)第7天和第14天光學顯微鏡下觀察巨噬細胞形態(tài)變化;流式細胞術(shù)檢測實驗組和對照組在不同時間后巨噬細胞表面細胞因子(CD64、CD163)表達情況。3 Ficoll密度梯度法分離健康成人外周血單個核細胞,GM-CSF誘導(dǎo)為巨噬細胞(M0),用對數(shù)生長期的SKOV3細胞培養(yǎng)上清處理14天,采用流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞亞型的改變及不同亞型細胞CD80、CD86和CD40的表達情況。4制作小鼠原位卵巢癌模型:用熒光素酶標記的SKOV3細胞懸液接種于BABL/cA-nu小鼠左側(cè)腎下極脂肪墊內(nèi),制作小鼠原位卵巢癌模型,接種5只。分別在接種的第2、4周兩個時間點檢測小鼠腹水中M2/M1比值,并觀察腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移情況情況。觀察前每只小鼠腹腔注射熒光素底物(1.5Mg/10g),1%戊巴比妥麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像,slⅠdebook4.0軟件進行分析。結(jié)果:1對照組M2/M1=0.75±0.31,Ⅰ+Ⅱ期M2/M1=2.14±0.37,Ⅲ+Ⅳ期M2/M1=3.01±0.45,Ⅲ+Ⅳ期患者腹水中M2/M1比值高于Ⅰ+Ⅱ期患者腹水中M2/M1比值,而Ⅰ+Ⅱ期M2/M1比值又高于對照組,每兩組相比,p0.05。2處理7天后,實驗組巨噬細胞形態(tài)改變明顯,細胞突起增加,細胞變細長,對照組細胞形態(tài)無明顯變化;處理14天后,實驗組巨噬細胞形態(tài)逐漸恢復(fù),對照組細胞形態(tài)仍無明顯變化。3流式細胞檢測巨噬細胞亞型百分比,培養(yǎng)第7天時,實驗組CD64-M1型巨噬細胞占(24.2±2.9)%,CD163-M2型巨噬細胞占(1.41±0.5)%,M1型巨噬細胞所占百分比較高;對照組CD64-M1型巨噬細胞占(15.4±2.3)%,CD163-M2型巨噬細胞占(2.05±0.7)%。培養(yǎng)第14天時,實驗組CD64-M1型巨噬細胞占(1.88±0.9)%,CD163-M2型巨噬細胞占(11.5±1.4)%,M2型巨噬細胞所占百分比升高;對照組CD64-M1型巨噬細胞占(12.10±0.9)%,CD163-M2型巨噬細胞占(3.30±1.3)%。早期主要是Mo向CD64-M1型巨噬細胞分化,晚期主要是M0向CD163-M2型巨噬細胞分化,而對照組此種現(xiàn)象似乎不存在。每個時間點的兩組相比,p0.05,差異有統(tǒng)計學意義。4流式細胞檢測巨噬細胞亞型比例,CD64-M1型巨噬細胞在第7天時M1/M0=1.61±0.29,在第14天時M1/M0=0.52±0.13;CD163-M2型巨噬細胞在第7天時M2/M0=0.73±0.19,在第14天時M2/M0=3.56±1.10;提示隨著時間推移,M1/M0比值降低,而M2/M0比值升高,差異均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5流式細胞術(shù)檢測巨噬細胞表面細胞因子的表達情況,用SKOV3細胞培養(yǎng)上清培養(yǎng)巨噬細胞14天后,流式細胞學檢測M1、M2中CD80、CD86和CD40的表達情況。(1)CD80在CD64-M1、CD163-M2上表達所占百分比分別為:(7.50±1.10)%、(6.60±0.98)%,兩組比較,p0.05,差異無統(tǒng)計學意義;(2)CD86在CD64-M1、CD163-M2上表達所占百分比分別為:(10.53±1.52)%、(10.30±1.50)%,兩組比較,p0.05,差異無統(tǒng)計學意義;(3)CD40在CD64-M1、CD163-M2上表達所占百分比分別為:(10.22±1.10)%、(2.50±0.32)%,兩組比較,p0.05,差異有統(tǒng)計學意義�？梢奀D40在CD163-M2型巨噬細胞的表達較CD64-M1型顯著降低,而CD80、CD86的表達無明顯改變。6小鼠原位卵巢癌模型:細胞接種BABL/cA-nu小鼠后,五只小鼠均有腫瘤生長,且4周時小鼠有明顯的腹腔內(nèi)播散及轉(zhuǎn)移。五只小鼠腹水中M2/M1比值在接種2周時分別為1.45、1.58、1.66、1.32、1.78;接種4周時分別為3.25、3.78、2.68、4.02、3.17;各小鼠4周時M2/M1比值較2周時明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。五只小鼠熒光強度(*10^6)在2周時分別為2.85、1.86、1.58、2.31、1.06;4周時分別為6.32、5.52、4.87、5.78、3.88;各小鼠4周時熒光強度值均較2周時明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。結(jié)論:1上皮性卵巢癌患者腹水中有巨噬細胞浸潤,早期患者M1型巨噬細胞所占比例較高,晚期患者M2型巨噬細胞所占比例較高,提示隨著卵巢癌患者腹腔微環(huán)境的變化,由最初的M0主要向M1分化轉(zhuǎn)變?yōu)镸0向主要M2分化;M2型巨噬細胞比例較高提示卵巢癌患者期別較晚。2SKOV3細胞培養(yǎng)上清液可改變巨噬細胞形態(tài),激活巨噬細胞免疫反應(yīng),隨著時間的推移,細胞形態(tài)恢復(fù),發(fā)生免疫抑制。3SKOV3細胞培養(yǎng)上清液可促進巨噬細胞分化,隨著時間的推移,亞型也有不同,早期主要是Mo向CD64-M1型巨噬細胞分化,晚期主要是M0向CD163-M2型巨噬細胞分化,而普通1640培養(yǎng)基則無此變化。4SKOV3細胞培養(yǎng)上清刺激后的巨噬細胞向不同巨噬細胞亞型分化,M2型巨噬細胞較M1型巨噬細胞表面細胞因子分子表達下調(diào),提示這些共刺激分子在巨噬細胞的活化及免疫應(yīng)答過程中很重要,可能與腫瘤細胞的免疫逃逸有關(guān)。5小鼠原位卵巢癌模型說明,在卵巢癌的早期主要是M1型巨噬細胞,晚期主要是M2型巨噬細胞;M2型巨噬細胞可能有助于卵巢癌腹腔的播散及遠處轉(zhuǎn)移。
【關(guān)鍵詞】：上皮性卵巢癌 腫瘤相關(guān)巨噬細胞 M1型巨噬細胞 M2型巨噬細胞 CD40
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-20
• 結(jié)果20-22
• 附圖22-26
• 附表26-28
• 討論28-31
• 結(jié)論31-32
• 參考文獻32-35
• 綜述 腫瘤相關(guān)巨噬細胞在卵巢癌中作用的研究進展35-44
• 參考文獻41-44
• 致謝44-45
• 個人簡歷45

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