本文關(guān)鍵詞：ANKRD18B基因在肺癌和大腸癌中的甲基化與表達(dá)分析

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【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?肺癌與大腸癌是常見的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計,在世界范圍內(nèi)腫瘤性疾病中,肺癌與大腸癌發(fā)病率及死亡率分別排在第一位及第三位,嚴(yán)重威脅人類健康。隨著對腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的研究,尋找有效的分子生物學(xué)標(biāo)志物對腫瘤高危人群開展早期篩選,對于降低肺癌及大腸癌的發(fā)生率及死亡率,改善患者的生活質(zhì)量有著重要意義。本課題組前期通過對腫瘤發(fā)生過程中異常甲基化改變進(jìn)行全基因組篩選,發(fā)現(xiàn)ANKRD18B基因(Ankyrin repeat domain 18B)在肺癌及大腸癌發(fā)生過程中明顯高甲基化,提示該基因異常甲基化可能與肺癌及大腸癌發(fā)生有關(guān)。同時,通過文獻(xiàn)檢索,未發(fā)現(xiàn)該基因異常甲基化和表達(dá)調(diào)控等在肺癌及大腸癌中的相關(guān)報道,因此具有較大的研究價值。根據(jù)前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們推測ANKRD18B基因在腫瘤發(fā)生過程中通過高甲基化而失活,可能是一個候選的抑癌基因,因此有必要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本證實(shí)該基因在肺癌及大腸癌中甲基化的變化情況以及與臨床病理的關(guān)系,同時對該基因在腫瘤發(fā)生過程中的作用和功能進(jìn)行初步研究。為進(jìn)一步研究該基因在生長發(fā)育、疾病發(fā)生、信號通路等方面的作用提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法:1.采用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR,MSP)方法分析肺癌組織及正常組織、肺癌患者血漿及痰液中ANKRD18B基因高甲基化的發(fā)生情況;對臨床資料完整的配對大腸癌患者癌組織及癌旁正常組織采用MSP方法分析ANKRD18B基因甲基化的變化情況;2.利用MSP方法,分析了來源于不同組織腫瘤細(xì)胞株和正常細(xì)胞中ANKRD18B基因甲基化情況;3.采用RT-PCR對去甲基化藥物5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-aza-dC)處理前后的腫瘤細(xì)胞中ANKRD18B基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析,評價ANKRD18B基因甲基化對其表達(dá)調(diào)控的影響;4.構(gòu)建ANKRD18B基因高表達(dá)細(xì)胞模型,采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)等方法,對該基因在腫瘤發(fā)生過程中的功能進(jìn)行初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1.采用msp方法分析了ankrd18b基因在98例肺癌組織和20例正常組織中的高甲基化發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):53.1%(52/98)腫瘤組織中該基因高甲基化,而20例正常組織中均未檢測到該基因高甲基化(0%,0/20)(p0.01)。2.應(yīng)用msp方法分析了來源于肺癌病人的65例痰液標(biāo)本和85例血漿標(biāo)本中ankrd18b基因甲基化發(fā)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn):36.9%(24/65)血漿標(biāo)本和38.8%(33/85)的痰標(biāo)本中能夠檢測出該基因的高甲基化。3.對病理資料完整的62例肺癌組織ankrd18b基因甲基化與臨床病理關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):該基因甲基化與年齡、性別以及腫瘤類型等沒有明顯的相關(guān)性(p0.05);但在吸煙病人腫瘤組織和早期腫瘤組織中該基因甲基化有一定增加,而且腫瘤細(xì)胞分化程度越低,該基因甲基化發(fā)生率越高(p=0.009)。4.對41例大腸癌組織及20例對應(yīng)癌旁正常組織采用甲基化特異性pcr(msp)法進(jìn)行了ankrd18b基因甲基化分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn):在20例癌旁正常組織中ankrd18b基因均未發(fā)生甲基化(0%,0/20),而在41例大腸癌組織中,該基因甲基化發(fā)生率為59%(24/41)(p0.01)。5.在肺癌細(xì)胞株a549、spc-a-1、95d、h1975、h358、h1650、ltep、h1395、h446和h460中高甲基化分析表明,ankrd18b甲基化發(fā)生率為90%(9/10),僅有h1650中未發(fā)生甲基化情況,而在正常hbe細(xì)胞中未檢測到該基因高甲基化發(fā)生。同時在大腸癌ht-29和sw480細(xì)胞中該基因也發(fā)生了高甲基化。6.在不同肺癌細(xì)胞株中采用rt-pcr及熒光定量pcr方法檢測該基因甲基化與其表達(dá)調(diào)控的關(guān)系。結(jié)果表明:該基因高甲基化的肺癌細(xì)胞中其表達(dá)明顯下調(diào),而正常支氣管上皮細(xì)胞hbe表達(dá)較高。為了進(jìn)一步證實(shí)該基因表達(dá)下調(diào)是由于其高甲基化導(dǎo)致的,對部分細(xì)胞采用去甲基化藥物5-雜氮-2’-脫氧胞苷(5-aza-dc)去甲基化處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ankrd18b基因高甲基化細(xì)胞經(jīng)去甲基化處理后,其表達(dá)明顯上調(diào),表明該基因甲基化直接調(diào)控其表達(dá)。由于該基因在腫瘤發(fā)生中明顯高甲基化失活,提示其可能是一個候選的抑癌基因。7.以h358細(xì)胞為基礎(chǔ),成功建立了該基因高表達(dá)細(xì)胞模型。通過細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)分析,發(fā)現(xiàn)該基因高表達(dá)后,能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤細(xì)胞克隆形成。實(shí)驗(yàn)初步證明ankrd18b基因具有抑癌作用。結(jié)論:1.ANKRD18B基因在肺癌組織、大腸癌組織、不同腫瘤細(xì)胞株中均明顯表現(xiàn)高甲基化,其甲基化發(fā)生率與腫瘤的發(fā)生有關(guān),是肺癌及大腸癌早期診斷的候選標(biāo)志物。2.ANKRD18B基因甲基化能調(diào)控該基因的表達(dá),且甲基化程度與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。3.ANKRD18B基因可抑制腫瘤生長,是一個潛在的抑癌基因。
【關(guān)鍵詞】：ANKRD18B基因 肺癌 大腸癌 DNA甲基化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2;R735.34
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-14
• 第二章ANKRD18B基因在肺癌及大腸癌發(fā)生過程中的甲基化與表達(dá)分析14-38
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-16
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法16-25
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-34
• 2.4 討論34-38
• 第三章ANKRD18B基因在腫瘤發(fā)生過程中生物學(xué)功能的初步研究38-44
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法40-41
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-43
• 3.4 討論43-44
• 全文總結(jié)44-45
• 參考文獻(xiàn)45-48
• 文獻(xiàn)綜述DNA甲基化與腫瘤48-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 學(xué)位期間發(fā)表論文59-60
• 致謝60

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本文編號：722258