本文關(guān)鍵詞：ECRG4在乳腺癌中的表達與調(diào)控機制及其抗腫瘤作用的研究

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【摘要】：目的食道癌相關(guān)基因4 (Esophageal cancer-related gene 4, ECRG4)是從人類食管上皮細胞內(nèi)分離出來的新基因,它因在食管鱗癌中的作用而首次被人們發(fā)現(xiàn)。其正式名稱為C2ORF40,基因定位于染色體2q12.2,編碼148個氨基酸殘基的多肽。據(jù)有關(guān)文獻報道,ECRG4在食管鱗癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中均表達下調(diào),在食管鱗癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲的功能。因此,在食管鱗癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中ECRG4被看作是一個潛在的抑癌基因,但ECRG4的確切功能目前尚無定論。近年來,有研究發(fā)現(xiàn)在食管鱗癌、結(jié)腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中都伴隨著ECRG4啟動子區(qū)CpG島高甲基化的現(xiàn)象,推測可能是這種高甲基化現(xiàn)象引起了ECRG4的基因轉(zhuǎn)錄沉默,從而導致ECRG4表達下調(diào)。但是,ECRG4表達調(diào)控機制仍罕見報道。2011年有研究發(fā)現(xiàn)ECRG4在乳腺癌中表達下調(diào)且與無病生存率相關(guān),本實驗室的前期工作也發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中ECRG4的表達是下調(diào)的,因此,我們決定針對ECRG4在乳腺癌中的表達與調(diào)控以及抗腫瘤功能進行進一步研究。本研究擬對ECRG4在乳腺癌組織的表達情況進行檢測,探究在乳腺癌組織以及乳腺癌細胞系中中ECRG4基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài),探討ECRG4啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與其表達之間的關(guān)系,并初步探索ECRG4在乳腺癌中的抗腫瘤功能,以期找到新的診斷和預后指標,為以后的分子靶向治療提供理論依據(jù)。方法1.應用半定量RT-PCR和熒光定量PCR(Q-PCR)方法檢測17例配對乳腺癌新鮮組織中內(nèi)源性ECRG4的mRNA表達水平；2. BSP (Bisulfite sequencing PCR)法檢測17例配對乳腺癌新鮮組織ECRG4啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)；3.應用BSP和熒光定量PCR(Q-PCR)檢測5-Aza-CdR處理前后SK-BR-3和MCF-7細胞的甲基化狀態(tài)及mRNA表達情況；4.構(gòu)建ECRG4-pcDNA3.1真核表達質(zhì)粒,并用ECRG4-pcDNA3.1表達質(zhì)�；�?qū)φ湛召|(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染SK-BR-3 和 MCF-7細胞,轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞總蛋白,Western Blotting檢測蛋白表達水平；5.MTT法檢測轉(zhuǎn)染ECRG4表達質(zhì)粒前后SK-BR-3和MCF-7細胞的增殖能力改變6.流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染ECRG4表達質(zhì)粒24 h后SK-BR-3和MCF-7細胞凋亡的改變7.細胞劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染ECRG4表達質(zhì)粒48 h后MCF-7細胞遷移能力的改變結(jié)果1. RT-PCR結(jié)果顯示有15例(15/17,88.2%)乳腺癌組織ECRG4的hRNA表達水平低于癌旁乳腺組織(P0.05)；2. RT-qPC R結(jié)果顯示有16例(16/17,94.1%)乳腺癌組織ECRG4的mRNA表達水平低于癌旁乳腺組織(P0.01)；3.在乳腺癌組織中ECRG4啟動子區(qū)存在明顯的高甲基化現(xiàn)象；4.5-Aza-CdR處理SK-BR-3和MCF-7細胞72 h后其ECRG4啟動子區(qū)甲基化程度明顯減弱,ECRG4 mRNA的表達得以恢復和上調(diào),且具有5-Aza-CdR濃度劑量依賴性；5.過表達E CRG4抑制了乳腺癌細胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖(P0.05)；6.過表達ECRG4抑制了乳腺癌細胞系MCF-7的遷移(P0.05)；7.過表達ECRG4能夠促進乳腺癌細胞系SK-BR-3和MCF-7的凋亡(P0.05)。結(jié)論1. ECRG4在乳腺癌中mRNA表達水平下調(diào)；2.在乳腺癌中ECRG4基因啟動子區(qū)存在異常高甲基化,并且這種高甲基化狀態(tài)與ECRG4在乳腺癌中的mRNA表達下調(diào)相關(guān)；3.過表達ECRG4能夠抑制乳腺癌細胞系SK-BR-3和MCF-7的增殖,并促進其凋亡；4.過表達ECRG4能夠抑制乳腺癌細胞系MCF-7的遷移。
【關(guān)鍵詞】：食管癌相關(guān)基因4 乳腺癌 甲基化 細胞增殖 細胞凋亡 細胞遷移
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 縮略詞表12-15
• 1 前言15-19
• 2 主要的儀器設(shè)備和試劑19-22
• 3 實驗方法22-35
• 4 結(jié)果35-51
• 5 討論51-53
• 6 結(jié)論53-54
• 7 參考文獻54-57
• 8 綜述57-65
• 參考文獻61-65
• 9 作者簡歷及在讀期間所取得科研成果65

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4 王s，

本文編號：720833