本文關鍵詞：結腸腺瘤息肉蛋白N端片段影響纖毛形成和細胞粘附的機制研究

  更多相關文章： 結腸腺瘤息肉蛋白 Hedgehog信號通路 AurA HDAC6 纖毛 細胞粘附 PI3K/AKT信號通路

【摘要】：Adenomatous Polyposis Coli,即結腸腺瘤息肉蛋白,簡稱APC,參與Wnt信號通路、細胞遷移、粘附、細胞極性、染色體正常分離等。纖毛是突出于細胞表面的一種亞細胞結構。纖毛形成受損或結構異常與多種疾病的發(fā)生相關。細胞粘附包括細胞間粘附和細胞基質間粘附,是惡性腫瘤始動轉移的關鍵。已有研究表明APC突變與纖毛形成受損和細胞粘附異常相關,但具體機制還不清楚。在多數(shù)APC突變的個體中都保留有其N端1至448個氨基酸的片段(命名為APC-N1),這一片段包括一個寡聚結構域,導致APC同源二聚體結構的形成,從而使蛋白失去活性。本課題主要對APC-N1片段影響纖毛形成和細胞粘附的機制進行研究,研究內容包括以下幾部分：第一部分：首先利用熒光定量PCR和Western印跡方法檢測了MDCK-GFP和MDCK-APC-N1穩(wěn)定細胞株的Hedgehog信號通路中兩個主要成員Ptchl和Glil的表達情況。結果顯示,與對照MDCK-GFP細胞相比,MDCK-APC-N1細胞中Ptchl和Glil的表達上調,表明過表達APC-N1激活Hedgehog信號通路。分別利用RNA干擾技術和抑制劑GANT61處理MDCK-APC-N1細胞,發(fā)現(xiàn)當Glil表達量降低時,細胞纖毛形成率顯著升高,表明過表達APC-N1是通過Hedgehog信號通路影響MDCK細胞纖毛形成。進一步利用RNA干擾技術敲減MDCK-APC-N1細胞中β-catenin,發(fā)現(xiàn)敲減β-catenin導致Gli1的表達量降低。以上結果表明APC-N1通過p-catenin影響Hedgehog信號通路,進而抑制纖毛形成。第二部分：利用熒光定量PCR檢測AurA的mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)AurA表達上調。分別通過RNA干擾技術和TSA藥物處理敲減AurA和抑制HDAC6表達,結果發(fā)現(xiàn)當AurA或HDAC6表達降低時,纖毛形成率明顯增加,表明過表達APC-N1是通過上調AurA/HDAC6表達而抑制纖毛形成。利用RNA干擾技術敲減Glil檢測AurA和HDAC6表達變化情況,結果發(fā)現(xiàn)Glil表達降低時,AurA和HDAC6表達量減少。這些結果表明,過表達APC-N1通過激活Hedgehog信號通路使AurA/HDAC6表達量上調,進而抑制纖毛形成。第三部分：利用細胞間粘附實驗、熒光定量PCR、Western印跡檢測APC-N1對細胞間粘附和相關粘附分子E-cadherin的影響,結果發(fā)現(xiàn)APC-N1降低細胞-細胞間粘附和E-cadherin的表達。利用結晶紫染色、熒光定量PCR, Western印跡檢測APC-N1對細胞基質間粘附和相關粘附分子CD29的影響,結果發(fā)現(xiàn)APC-N1過表達提高細胞-基質間粘附能力和CD29的表達。利用RNA干擾技術敲減β-catenin導致E-cadherin表達上調卻對CD29沒有明顯影響,表明APC-N1通過β-catenin影響E-cadherin的表達。LY294002藥物處理MDCK-APC-N1細胞檢測E-cadherin和CD29的表達情況,結果顯示P-AKT(T308)蛋白水平減少,E-cadherin表達量上調,CD29表達降低。以上結果表明APC-N1通過PI3K/AKT信號通路影響細胞粘附。綜上所述,本研究探討了APC-N1影響纖毛形成和細胞粘附的機制,結果表明APC-N1通過β-catenin激活Hedgehog信號通路,進而上調AurA/HDAC6表達,導致纖毛形成受損；此外,APC-N1通過PI3K/AKT信號通路影響細胞粘附。
【關鍵詞】：結腸腺瘤息肉蛋白 Hedgehog信號通路 AurA HDAC6 纖毛 細胞粘附 PI3K/AKT信號通路
【學位授予單位】：山西大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 中文摘要12-14
• ABSTRACT14-16
• 第一章 文獻綜述16-29
• 1.1 結腸腺瘤息肉蛋白16-18
• 1.1.1 結腸腺瘤息肉蛋白的結構及其氨基酸序列組成16-17
• 1.1.2 結腸腺瘤息肉蛋白的功能17-18
• 1.1.3 結腸腺瘤息肉蛋白突變與相關疾病18
• 1.2 纖毛18-21
• 1.2.1 纖毛的結構及組裝解聚18-19
• 1.2.2 纖毛的功能19-20
• 1.2.3 纖毛與Hedgehog信號通路20-21
• 1.3 結腸腺瘤息肉蛋白、Hedgehog信號通路和纖毛21-22
• 1.4 細胞粘附22-23
• 1.4.1 細胞粘附簡介22-23
• 1.4.2 PI3K/AKT信號通路和細胞粘附23
• 1.5 結腸腺瘤息肉蛋白和細胞粘附23-24
• 1.6 研究目的及意義24
• 參考文獻24-29
• 第二章 APC-N1通過β-catenin激活Hedgehog信號通路進而抑制纖毛形成29-42
• 2.1 實驗材料29-31
• 2.1.1 細胞株和質粒29-30
• 2.1.2 抗體及實驗試劑30-31
• 2.2 實驗方法31-34
• 2.2.1 MDCK細胞的培養(yǎng)31
• 2.2.2 MDCK細胞的復蘇31
• 2.2.3 MDCK細胞的凍存31-32
• 2.2.4 RNA干擾32
• 2.2.5 抑制劑GANT61藥物處理32
• 2.2.6 總RNA提取及反轉錄32-33
• 2.2.7 熒光定量PCR33
• 2.2.8 總蛋白提取33
• 2.2.9 Western印跡33-34
• 2.2.10 免疫熒光染色34
• 2.2.11 統(tǒng)計學分析34
• 2.3 實驗結果34-40
• 2.3.1 APC-N1片段過表達激活Hedgehog信號通路34-36
• 2.3.2 APC-N1通過Hedgehog信號通路抑制纖毛的生長36-38
• 2.3.3 APC-N1通過β-catenin激活Hedgehog信號通路38-40
• 2.4 討論40
• 參考文獻40-42
• 第三章 APC-N1通過Hedgehog信號通路調節(jié)AurA/HDAC6進而抑制纖毛生長42-50
• 3.1 實驗材料42-43
• 3.1.1 細胞株和質粒42
• 3.1.2 抗體及試劑42-43
• 3.2 實驗方法43-44
• 3.2.1 MDCK-APC-N1細胞的培養(yǎng)43
• 3.2.2 MDCK-APC-N1細胞的復蘇43
• 3.2.3 MDCK-APC-N1細胞的凍存43
• 3.2.4 抑制劑TSA藥物處理43
• 3.2.5 RNA干擾43
• 3.2.6 總RNA提取及反轉錄43
• 3.2.7 免疫熒光染色43
• 3.2.8 熒光定量PCR43-44
• 3.2.9 總蛋白提取及Western印跡44
• 3.2.10 統(tǒng)計學分析44
• 3.3 實驗結果44-47
• 3.3.1 APC-N1通過上調AurA和HDAC6影響纖毛形成44-46
• 3.3.2 APC-N1通過Hedgehog信號通路調節(jié)AurA和HDAC6進而抑制纖毛形成46-47
• 3.4 討論47-48
• 參考文獻48-50
• 第四章 APC-N1對犬腎細胞MDCK細胞粘附的影響50-61
• 4.1 實驗材料50-51
• 4.1.1 細胞株和質粒50
• 4.1.2 抗體及試劑50-51
• 4.2 實驗方法51-52
• 4.2.1 MDCK-APC-GFP、MDCK-APC-N1細胞的培養(yǎng)、復蘇、凍存51
• 4.2.2 抑制劑LY294002藥物處理51
• 4.2.3 細胞聚集實驗51
• 4.2.4 細胞-基質粘附實驗51
• 4.2.5 RNA干擾51
• 4.2.6 總RNA提取及反轉錄51
• 4.2.7 熒光定量PCR51-52
• 4.2.8 總蛋白提取及Western印跡52
• 4.2.9 統(tǒng)計學分析52
• 4.3 實驗結果52-56
• 4.3.1 APC-N1過表達對MDCK細胞間粘附和E-cadherin表達的影響52-53
• 4.3.2 APC-N1過表達對MDCK細胞基質間粘附和CD29表達的影響53-55
• 4.3.3 APC-N1通過β-catenin影響E-cadherin表達55
• 4.3.4 APC-N1通過PI3K/AKT信號通路影響E-cadherin和CD29的表達55-56
• 4.4 討論56-57
• 參考文獻57-61
• 結論與討論61-63
• 附錄1 英文縮略語表63-65
• 附錄2 主要試劑配制65-67
• 附錄3 實驗主要儀器設備67-68
• 攻讀學位期間取得的研究成果68-69
• 致謝69-70
• 個人簡歷及聯(lián)系方式70-71
• 承諾書71-72

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 李斌;王濟明;;組蛋白去乙�；�6(HDAC6)與腫瘤[J];臨床和實驗醫(yī)學雜志;2006年12期

2 李文玲;祝文思;牛海波;朱峰;宋莉;李卓玉;;腺瘤性結腸息肉(APC)蛋白截短突變對MDCK細胞中細胞-基質和細胞-細胞間黏附的影響(英文)[J];復旦學報(醫(yī)學版);2013年02期

3 戴文斌;;Wnt通路成員APC、β-catenin、c-myc及黏附分子E-cadherin與大腸癌的關系[J];中國腫瘤臨床與康復;2007年01期

，

本文編號：720826