本文關鍵詞：重組溶瘤腺病毒對人腫瘤細胞的體內、外抑制作用研究

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【摘要】：近年來我國癌癥的發(fā)病率和死亡率逐年攀升,嚴重威脅著人類健康及生命。據統(tǒng)計僅2015年中國新增癌癥患者人數(shù)約為429.2萬,死亡人數(shù)約為281.4萬。目前臨床上多采用手術和放化療法治療癌癥,但因上述療法缺乏對腫瘤細胞的特異性,導致治療過程中正常細胞也嚴重受損,因此急需探索腫瘤治療的新方法。基因治療是一種惡性腫瘤的生物療法,但關鍵問題是如何安全高效地將治療基因遞送至人體內。目前腫瘤基因治療中腺病毒載體應用最廣泛,溶瘤腺病毒的優(yōu)勢是僅殺傷腫瘤細胞但不傷害正常細胞,因此可作為一種抗腫瘤基因藥物加以應用。凋亡素(Apoptin)是雞貧血病毒VP3基因編碼的一種功能蛋白,僅在腫瘤細胞內復制;血凝素-神經氨酸酶(HN)是新城疫病毒的一種表面蛋白,能激活細胞凋亡途徑。因此本研究構建表達Apoptin和HN的重組腺病毒Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1a)和Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a),研究其是否能成為有效的抗腫瘤基因藥物。本研究分別用Ad-VT感染人骨肉瘤和正常細胞,以及用Ad-HN-PEG3p-E1a感染人胃癌細胞。通過MTT法檢測重組腺病毒對腫瘤細胞和正常細胞的增殖抑制率。體外實驗中,在熒光顯微鏡下觀察腫瘤細胞和正常細胞經AO/EB染色、DAPI染色后的形態(tài)學變化;再利用Annexin V/PI方法通過流式細胞術和染色分析重組腺病毒對腫瘤細胞的抑制作用方式,并通過Caspase酶活性檢測以上重組腺病毒對腫瘤細胞的抑制作用途徑。體內實驗中,采取構建動物模型并考察腫瘤生長趨勢和平均生存期。Ad-VT和Ad-HN-PEG3p-E1a能抑制兩種腫瘤細胞增殖,并伴隨一定的時間效應和劑量效應關系,但對正常細胞無影響。體外實驗中驗證了以上兩種重組腺病毒能誘導腫瘤細胞凋亡,且是通過激活Caspase相關酶方式實現(xiàn)的。體內實驗中,Ad-VT和Ad-HN-PEG3p-E1a能有效減緩瘤體生長并能延長平均生存期。結果表明,Ad-VT(Ad-Apoptin-hTERTp-E1a)和Ad-HP(Ad-HN-PEG3p-E1a)對腫瘤細胞有特異性抑制作用,對于今后腫瘤治療的臨床應用具有一定的參考價值。
【關鍵詞】：溶瘤腺病毒 凋亡素 病毒載體 癌癥
【學位授予單位】：長春工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.5
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 英文縮略語8-9
• 第一章 緒論9-19
• 1.1 癌癥與基因治療9-10
• 1.2 基因轉移方法10
• 1.3 非病毒載體10-12
• 1.3.1 生物載體10-12
• 1.3.2 非傳統(tǒng)生物載體12
• 1.4 病毒載體12-16
• 1.4.1 腺病毒載體13-14
• 1.4.2 γ 反轉錄病毒載體和慢病毒載體14-15
• 1.4.3 皰疹病毒15
• 1.4.4 腺相關病毒15-16
• 1.5 體外細胞基因治療16-17
• 1.5.1 細胞的選擇16-17
• 1.5.2 載體的選擇17
• 1.6 基因治療面臨的挑戰(zhàn)17-19
• 1.6.1 安全性問題17-18
• 1.6.2 轉基因表達18
• 1.6.3 從實驗室研究到臨床應用18-19
• 第二章 重組腺病毒有效抑制人腫瘤細胞增殖19-31
• 2.1 實驗材料19-20
• 2.1.1 重組腺病毒19
• 2.1.2 細胞19
• 2.1.3 試劑19-20
• 2.1.4 儀器設備20
• 2.2 實驗方法20-21
• 2.2.1 復蘇和傳代HEK-293細胞20
• 2.2.2 擴增重組腺病毒20-21
• 2.2.3 測定重組腺病毒毒價21
• 2.2.4 MTT檢測21
• 2.3 結果21-29
• 2.3.1 Ad-VT作用時間對OS-732細胞的抑制作用22-23
• 2.3.2 Ad-VT作用時間對L02細胞的抑制作用23-24
• 2.3.3 Ad-VT作用劑量對OS-732細胞的抑制作用24-26
• 2.3.4 Ad-VT作用劑量對L02細胞的抑制作用26-27
• 2.3.5 Ad-HP對SGC7901細胞的抑制作用27-29
• 2.4 討論29-31
• 第三章 重組腺病毒誘導腫瘤細胞凋亡31-41
• 3.1 實驗材料和儀器31-32
• 3.1.1 重組腺病毒31
• 3.1.2 細胞31
• 3.1.3 試劑31-32
• 3.1.4 儀器設備32
• 3.2 實驗方法32-33
• 3.2.1 AO/EB染色32
• 3.2.2 DAPI染色32
• 3.2.3 Annexin V檢測32-33
• 3.2.4 Caspase活性檢測33
• 3.3 結果33-39
• 3.3.1 AO/EB染色結果33-34
• 3.3.2 DAPI染色結果34-36
• 3.3.3 Annexin V檢測結果36-37
• 3.3.4 Caspase活性檢測結果37-39
• 3.4 討論39-41
• 第四章 重組腺病毒的體內抑瘤作用41-46
• 4.1 實驗材料41-42
• 4.1.1 重組腺病毒41
• 4.1.2 細胞41
• 4.1.3 實驗動物41
• 4.1.4 試劑41-42
• 4.1.5 儀器設備42
• 4.2 實驗方法42-43
• 4.2.1 重組腺病毒的純化42
• 4.2.2 動物模型建立42
• 4.2.3 模型分組及治療方案42
• 4.2.4 腫瘤生長趨勢42-43
• 4.2.5 平均生存期43
• 4.3 結果43-44
• 4.3.1 腫瘤生長趨勢43
• 4.3.2 平均生存期43-44
• 4.4 討論44-46
• 第五章 結論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻48-54
• 作者簡介54
• 攻讀碩士學位期間研究成果54

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本文編號：718883