發(fā)布時間：2017-08-22 10:12

  本文關(guān)鍵詞：干預(yù)Wip1基因?qū)θ烁伟┘毎礖uh-7的影響研究

  更多相關(guān)文章： 肝癌 Wip1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 siRNA 細胞生物學特性

【摘要】：目的：通過使用靶向質(zhì)粒,siRNA轉(zhuǎn)染的方法,干預(yù)人肝癌細胞系Huh-7細胞中Wip1基因的表達,使其表達分別上調(diào)及下調(diào)。在驗證Wip1基因被干預(yù)以后,觀察Huh-7細胞在wipl蛋白表達、增殖能力、遷移能力、侵襲能力等細胞生物學特性方面的變化。初步探討導致Huh-7細胞發(fā)生細胞生物學特性變化的原因及機制,為后期的動物實驗提供理論支持,為肝癌的臨床治療、干預(yù)提供一種新的方法及思路。方法：通過轉(zhuǎn)染試劑NanoFection Transfection Reagent (ExCell)的介導,分別將靶向Wip1基因的質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染入人肝癌細胞株Huh-7細胞。靶向Wip1基因的質(zhì)粒能夠上調(diào)Wip1基因表達,而siRNA則通過介導wip1相關(guān)mRNA的降解從而下調(diào)Wipl基因的表達。在轉(zhuǎn)染完成24h后,行PCR實驗,驗證Huh-7細胞內(nèi)Wip1基因mRNA的表達量的是否發(fā)生了變化。若其表達量有變化,則在轉(zhuǎn)染完成48h后,行Western blot實驗,檢測Huh-7細胞內(nèi)wip1蛋白的表達量有無變化；轉(zhuǎn)染完成24h后,行CCK-8細胞增殖-毒性檢測實驗,檢測Huh-7細胞在24h、48h、72h三個時間段內(nèi)細胞的增殖能力有無變化；轉(zhuǎn)染完成24h后,行細胞劃痕實驗,檢測Huh-7細胞在24h、48h、72h三個時間段內(nèi)細胞的遷移能力有無變化：轉(zhuǎn)染完成24h后,行Transwell細胞侵襲實驗,檢測Huh-7細胞在24h內(nèi)的細胞侵襲能力有無變化。結(jié)果：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成24h后,Huh-7細胞內(nèi)Wip1基因mRNA的表達量較未轉(zhuǎn)染時上調(diào)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染完成48h后,Huh-7細胞內(nèi)wip1蛋白的表達量較未轉(zhuǎn)染時上調(diào)。CCK-8細胞增殖-毒性檢測實驗方面,在各個時間觀察段及各個細胞數(shù)量梯度中,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在450nm處的吸光度(OD值)均較未轉(zhuǎn)染組高,各個時間段及各個細胞數(shù)量梯度組的增殖率在107.42%-176.36%之間,大多集中在130%左右。細胞劃痕實驗方面,未轉(zhuǎn)染組Hu_h-7細胞與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Huh-7細胞在24h、48h、72h處的劃痕遷移距離分別為：34.78±4.77 μmVS61.60±2.02 μ m(t=8.97,P0.05)；33.98±3.48 μm VS 64.75±4.67 u m(t=9.19,P0.05)；35.49±0.90μm VS 67.89±4.23 μm(t=13.01,P0.05)。Transwell細胞侵襲實驗方面,未轉(zhuǎn)染組Huh-7細胞與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組Huh-7細胞三次Transwell實驗的遷移細胞數(shù)分別為：90,00±3.00VS178.67±5.77(t=23.65,P0.05)：74.33±26.95 VS 209.00±32.91(t=-5.48,P0.05)：79.33±20.74 VS 208.67±73.24(t=13.01,P0.05)。siRNA轉(zhuǎn)染完成24h后,siRNA干擾組的Huh-7細胞內(nèi)Wipl基因mRNA的表達量較Negative Control (NC)組的下調(diào)。siRNA轉(zhuǎn)染完成48h后,siRNA干擾組的Huh-72細胞wip1蛋白的表達量較NC組的下調(diào)。CCK-8細胞增殖-毒性檢測實驗方面,在各個時間觀察段及各個細胞數(shù)量梯度中,siRNA干擾組在450nm處的OD值均較NC組低,各個時間段及各個細胞數(shù)量梯度組的抑制率在12.37%-40.81%之間,大多集中在30%左右。細胞劃痕實驗方面,NC組Huh-7細胞與siRNA干擾組Huh-7細胞在24h、48h、72h處的劃痕遷移距離分別為：31.24±4.42 μ m VS 16.04±6.21 μ m(t=18.53,P0.05)：31.33±2.13 μm VS 18.20±5.67 μm(t=16.09,P0.05)；32.45±3.08 μmVS18.99±5.32 u m(t=16.50,P0.05)。Transwell細胞侵襲實驗方面,NC組Huh-7細胞與siRNA干擾組Huh-7細胞三次Transwell實驗的遷移細胞數(shù)分別為：74.00±12.17 VS 33.00±10.44(t=14.91,P0.05)；77.00±5.00 VS32.67±2.08(t=22.05,P0.05)；81.33±17.16 VS 29.30±2.51(t=20.32,P0.05)。結(jié)論：經(jīng)過靶向Wip1基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,人肝癌細胞株Huh-7細胞內(nèi)Wip1基因mRNA的表達水平上調(diào),wip1蛋白的表達水平上調(diào),增殖能力增強,遷移能力增強,侵襲能力增強。經(jīng)過靶向Wip1基因的siRNA轉(zhuǎn)染后,人肝癌細胞株Huh-72細胞內(nèi)Wip1基因]mRNA的表達水平下調(diào),wip1蛋白的表達水平下調(diào),增殖能力被抑制,遷移能力被抑制,侵襲能力被抑制。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 Wip1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 siRNA 細胞生物學特性
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符號說明11-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-26
• 結(jié)果26-28
• 討論28-32
• 結(jié)論32-33
• 附圖及附表33-41
• 參考文獻41-45
• 致謝45-46
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄46-47
• 附件47

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 朱X熹;林在堯;周陽生;秦愛霞;;鴨的實驗性原發(fā)性肝癌[J];畜牧獸醫(yī)學報;1980年02期

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本文編號：718528