本文關(guān)鍵詞：跨膜銜接蛋白CBP及其棕櫚�；稽c(diǎn)突變在CD59介導(dǎo)的T系白血病中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究

  更多相關(guān)文章： CD59 CBP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 實(shí)時(shí)定量PCR 電鏡

【摘要】：目的探討跨膜銜接蛋白CBP與GPI錨固蛋白CD59在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用,進(jìn)一步研究CBP與CD59在信號傳遞中的相互關(guān)系及作用機(jī)制,為白血病的治療方面提供了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法選取Jurkat細(xì)胞系作為研究對象,構(gòu)建CBP-EGFP慢病毒載體和CBP棕櫚�；稽c(diǎn)突變-EGFP慢病毒載體,建立了穩(wěn)定表達(dá)CBP-EGFP/CBP-M-EGFP的細(xì)胞系。使用CD59單克隆抗體分別刺激各組細(xì)胞,采用免疫熒光化學(xué)技術(shù)檢測CBP、CD59在細(xì)胞上的表達(dá)及定位關(guān)系;光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的基礎(chǔ)生長狀態(tài);電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的復(fù)雜程度及超微結(jié)構(gòu)的變化。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的基本參數(shù)及凋亡情況;CCK8法檢測細(xì)胞的增殖效率。Western Blot檢測與CBP結(jié)合的抑制性酪氨酸激酶CSK以及TCR活化通路中重要的信號分子LCK、FYN、PLCG1及ZAP70的表達(dá)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測了轉(zhuǎn)染后CBP基因的表達(dá)情況,同時(shí)檢測了T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要信號分子CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2的表達(dá)。結(jié)果①激光共聚焦結(jié)果顯示:共聚焦顯微鏡可見CBP、CD59分子定位于細(xì)胞膜上;CD59抗體交聯(lián)刺激后,CBP-EGFP組可見CBP分子和CD59分子均呈戒指環(huán)狀或點(diǎn)簇狀高亮熒光分布,且分布區(qū)域存在交叉重疊,而CBP-M-EGFP組CBP分子與CD59分子在部分細(xì)胞中均出現(xiàn)點(diǎn)簇狀聚集現(xiàn)象,但兩者并不重疊。②光鏡下發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒的Jurkat細(xì)胞皺縮細(xì)胞增多,大小均一性較差,以小個(gè)頭細(xì)胞為主,CBP-M-EGFP組細(xì)胞形態(tài)大小不一,但以大個(gè)頭細(xì)胞多見。③電鏡可見轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器較Jurkat細(xì)胞復(fù)雜,有兩組均出現(xiàn)自噬體樣團(tuán)塊,但CBP-EGFP組較多,同時(shí)核質(zhì)比降低、胞核變小、不規(guī)則,部分細(xì)胞器有腫脹現(xiàn)象。④實(shí)時(shí)定量PCR顯示,轉(zhuǎn)染病毒后,CBP基因在CBP-EGFP組和CBP-M-EGFP組的表達(dá)均上調(diào)。與CBP結(jié)合的抑制性酪氨酸激酶CSK基因表達(dá)量在CBP-EGFP組上調(diào),在CBP-M-EGFP組是下調(diào)的。CD59、CSK、LCK、PLCG1及GRB2在CBP-EGFP組是下調(diào)的,而在CBP-M-EGFP組的結(jié)果則是相反的。⑤Western Blot顯示,與CBP結(jié)合的抑制性蛋白CSK的表達(dá)量是增加的,CD59單抗作用以后CSK的表達(dá)量進(jìn)一步增加;在CBP-EGFP組TCR活化通路中蛋白LCK、FYN、ZAP70表達(dá)量均下降,而CBP-M-EGFP組則是上升的。⑥CCK8結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染CBP-EGFP病毒載體后,細(xì)胞的活性和增殖效率明顯下降;而轉(zhuǎn)染突變了棕櫚酰化位點(diǎn)的病毒載體,細(xì)胞活性增加,增殖效率上升。⑦細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,CBP-EGFP組中,主要為早期凋亡細(xì)胞,比例為40%左右,中晚期凋亡細(xì)胞的比例在15%左右,CBP-M-EGFP組中,早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡細(xì)胞均存在,早期凋亡細(xì)胞比例為25%左右,中晚期凋亡細(xì)胞比例為12%左右;CD59抗體交聯(lián)后,CBP-EGFP組細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯增加,隨著交聯(lián)時(shí)間的延長,凋亡數(shù)目逐漸增加,CBP-M-EGFP組隨著交聯(lián)時(shí)間的延長,凋亡數(shù)目逐漸減少。結(jié)論高表達(dá)CBP能有效抑制Jurkat細(xì)胞的增殖,突變CBP棕櫚�；稽c(diǎn)后抑制效果明顯下降,同時(shí)利用CD59抗體交聯(lián),證實(shí)CD59可借助棕櫚�；鶊F(tuán)使CBP分子磷酸化,向細(xì)胞內(nèi)傳遞抑制信號,引起TCR活化通路中一系列相關(guān)分子的變化,為探討CD59與CBP在T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相互作用奠定了基礎(chǔ),為探索T系淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),同時(shí)也為臨床T系白血病的診斷、防治提供了新的靶標(biāo)。
【關(guān)鍵詞】：CD59 CBP 信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 實(shí)時(shí)定量PCR 電鏡
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-9
• 引言9-11
• 第一章 材料和方法11-26
• 1.1 材料11-13
• 1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器11
• 1.1.2 細(xì)胞株與病毒載體11-12
• 1.1.3 抗體12
• 1.1.4 其他主要試劑12-13
• 1.1.5 常用液體的配置13
• 1.2 方法13-26
• 1.2.1 Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)13-15
• 1.2.1.1 細(xì)胞換液與細(xì)胞傳代13-14
• 1.2.1.2 細(xì)胞凍存與細(xì)胞復(fù)蘇14-15
• 1.2.2 Jurkat細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率的測定15-17
• 1.2.2.1 病毒轉(zhuǎn)染流程15-16
• 1.2.2.2 病毒轉(zhuǎn)染效率的測定16
• 1.2.2.3 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立16-17
• 1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)CD59與CBP的定位17
• 1.2.4 透射電鏡17-18
• 1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR18-21
• 1.2.5.1 各細(xì)胞系總RNA的提取與純化18-19
• 1.2.5.2 cDNA的合成19
• 1.2.5.3 Real-time q PCR反應(yīng)19-21
• 1.2.6 Western Blot21-23
• 1.2.6.1 總蛋白的提取21
• 1.2.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳21-23
• 1.2.6.3 轉(zhuǎn)膜23
• 1.2.6.4 孵育抗體及檢測23
• 1.2.7 功能檢測23-25
• 1.2.7.1 CD59單克隆抗體交聯(lián)處理細(xì)胞23-24
• 1.2.7.2 細(xì)胞增殖試驗(yàn)24
• 1.2.7.3 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)24-25
• 1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25-26
• 第二章 結(jié)果26-42
• 2.1 Jurkat細(xì)胞的培養(yǎng)26
• 2.2 Jurkat細(xì)胞病毒轉(zhuǎn)染26-30
• 2.2.1 相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞26-27
• 2.2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察病毒轉(zhuǎn)染效率27-28
• 2.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察抗體作用前后CBP的定位28-29
• 2.2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察CD59與CBP的定位及關(guān)系29-30
• 2.3 電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)30-31
• 2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測T細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達(dá)31-35
• 2.4.1 CBP與抑制性酪氨酸激酶CSK基因的表達(dá)32-33
• 2.4.2 TCR活化通路中重要的信號分子基因的表達(dá)33-35
• 2.5 Western Blot35-37
• 2.5.1 抑制性酪氨酸激酶CSK與LCK的表達(dá)35-36
• 2.5.2 TCR活化通路中重要的信號分子的表達(dá)36-37
• 2.6 功能檢測37-42
• 2.6.1 CCK8檢測Jurkat細(xì)胞增殖37-38
• 2.6.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測Jurkat細(xì)胞凋亡38-42
• 2.6.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的物理參數(shù)38
• 2.6.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡38-42
• 第三章 討論42-46
• 3.1 跨膜蛋白 CBP 是在 T 淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起到抑制作用42-44
• 3.2 GPI 錨固蛋白 CD59 借棕櫚�；鶊F(tuán)與 CBP 共同調(diào)節(jié) T 淋巴細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻(xiàn)47-49
• 綜述49-63
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果63-64
• 附錄64-67
• 致謝67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 褚波;黃雪峰;唐云明;;慢病毒載體及其應(yīng)用進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2008年01期

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本文編號：718422