本文關(guān)鍵詞：泊馬度胺聯(lián)合CAR-T細胞抗多發(fā)性骨髓瘤效應(yīng)的實驗研究

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【摘要】：多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是以異常漿細胞增生,最終導(dǎo)致單克隆免疫球蛋異常聚集的B系惡性腫瘤,近年來,MM的發(fā)病率在包括我國在內(nèi)的許多國家都成上升趨勢,除隨著社會老齡化及社會環(huán)境因素改變致使本病實際發(fā)病率確有增加外,也和醫(yī)務(wù)人員對本病的認識提高、診斷技術(shù)的進步是檢出本病例數(shù)增加的緣故,而目前常用的基礎(chǔ)治療無法實現(xiàn)治愈,且受制于患者臟器功能、年齡、經(jīng)濟等多方面因素。因此急需尋找新的更加安全、有效、靶向性強、副作用輕的治療方法。雖然第一代免疫調(diào)節(jié)劑沙利度胺,第二代免疫調(diào)節(jié)劑來那度胺,蛋白酶體抑制劑硼替佐米的出現(xiàn)顯著改善了MM患者的臨床預(yù)后,但隨著病程的延長,大部分患者最終仍是走向復(fù)發(fā)、耐藥。泊馬度胺(Pomalidomide, CC-4047)的藥物結(jié)構(gòu)和沙利度胺類似,是由美國Celgene公司研發(fā)的第三代免疫調(diào)節(jié)劑。泊馬度胺能減少例如白介素-6、腫瘤壞死因子-α等促進瘤細胞存活的細胞因子、下調(diào)MM細胞關(guān)鍵功能信號等發(fā)揮抗骨髓瘤作用。泊馬度胺可直接刺激患者T淋巴細胞,增加IFN-γ等Thl型細胞因子的分泌,產(chǎn)生具有腫瘤特異性的Thl型反應(yīng)。國外臨床研究結(jié)果提示,泊馬度胺聯(lián)合地塞米松治療復(fù)發(fā)、難治性患者能使部分患者獲得緩解,延長患者生存期,且相較于第一代、第二代免疫調(diào)節(jié)劑藥理作用更強,耐受性更好,毒性更低更安全。但仍有部分患者對治療缺乏有效的臨床反應(yīng),面對這部分患者的治療,現(xiàn)有的基礎(chǔ)治療非常有限。T淋巴細胞在腫瘤免疫應(yīng)答中起主要作用,但腫瘤可通過多種機制逃避T淋巴細胞識別和殺傷,抑制T細胞功能。嵌合抗原受體是一種合成的跨膜蛋白,經(jīng)基因修飾后,靶向作用于腫瘤細胞,和既往的T細胞過繼免疫治療相比,CAR-T細胞的最大優(yōu)勢在于其殺傷性不受MHC限制,靶向性強。本研究選取以慢病毒為載體轉(zhuǎn)染T細胞,表達嵌合抗原受體的T淋巴細胞可靶向性的與MM細胞表面高水平表達的CD138抗原相結(jié)合,產(chǎn)生明顯的抗骨髓瘤細胞效應(yīng),增加骨髓瘤細胞凋亡。本研究通過觀察不同濃度下的泊馬度胺體外作用于MM細胞株RPMI8226、U266,觀察泊馬度胺在體外對RPMI8226、U266凋亡、細胞周期等影響。并進一步應(yīng)用CD138-CAR-T、泊馬度胺聯(lián)合CD138-CAR-T細胞體外殺傷RPMI8226、U266。第一部分泊馬度胺對多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266及RPMI8226的影響目的：通過體外實驗探討不同濃度的泊馬度胺對人多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266、RPMI8226增殖、凋亡的影響,NF-κB的表達變化,凋亡信號Caspase-8、核轉(zhuǎn)錄因子IRF-4以及CRBN基因的表達變化。方法：將泊馬度胺分別作用于骨髓瘤細胞U266、RPM18226,采用流式細胞術(shù)檢測不同濃度下細胞的凋亡率、細胞周期分布、胞核NF-κB的表達變化；RT-PCR檢測IRF-4、Caspase-8、及CRBN mRNA表達量的變化。結(jié)果：和對照組(藥物濃度為0 ug/ml)相比,泊馬度胺對RPMI8226細胞株無任何明顯作用(P0.05),結(jié)果不隨藥物濃度改變。與對照組(藥物濃度為0 ug/ml)相比,流式結(jié)果顯示泊馬度胺可將U266細胞阻滯于GO/G1期,誘導(dǎo)細胞凋亡,其作用呈濃度依賴性(P0.05)。泊馬度胺作用48h后,U266細胞IRF-4、 CRBN mRNA表達均下降(P0.05),Caspase-8表達上調(diào)(P0.05)。結(jié)論：泊馬度胺可降低U266細胞IRF-4、、CRBN mRNA表達,上調(diào)Caspase-8表達,誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡,可將細胞阻滯于G0/G1期；但泊馬度胺對多發(fā)耐藥的細胞株RPM18226無明顯的作用。第二部分泊馬度胺聯(lián)合CD138-CAR-T對多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226、U266的體外殺傷作用目的：體外觀察CD138-CAR-T對人MM細胞株RPMI8226和U266細胞的靶向殺傷作用,探討泊馬度胺對CD138-CAR-T細胞分泌IFN-γ及其殺傷作用的影響。方法：采用CFSE/7AAD雙標(biāo)法檢測CD138-CAR-T及CD138-CAR-T聯(lián)合泊馬度胺對RPMI8226、U266細胞的殺傷活性。ELISA法檢測CD138-CAR-T細胞分泌IFN-γ的變化。結(jié)果：CD138-CAR-T細胞作用18 h后,對RPMI8226、U266細胞的殺傷活性分別為(55.2±3.9)%、(85.1±2.4)%,對照組分別為(7.0±1.5)%、(12.5±2.1)%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均0.01)；與CD138-CAR-T細胞組比較,CD138-CAR-T細胞聯(lián)合泊馬度胺(2.5 ug/ml)作用18h后,對RPMI8226、U266細胞的殺傷活性無明顯變化(P0.05)。與CD138-CAR-T細胞組比較,CD138-CAR-T細胞和塒細胞共培養(yǎng)組IFN-γ分泌水平顯著增高；與共培養(yǎng)組比較,加入泊馬度胺后能顯著促進IFN-γ的釋放,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論：CD138-CAR-T細胞對U266細胞、多發(fā)耐藥細胞株RPMI8226有明顯的殺傷作用；CD138-CAR-T細胞與瑚細胞共培養(yǎng)能促進CD138-CAR-T分泌IFN-γ;加入泊馬度胺共培養(yǎng)后能促進CD138-CAR-T細胞分泌IFN-γ。
【關(guān)鍵詞】：RPMI8226細胞株 U266細胞株 多發(fā)性骨髓瘤 泊馬度胺 泊馬度胺 T淋巴細胞 多發(fā)性骨髓瘤 嵌合抗原受體
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.3
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 第一部分：泊馬度胺對多發(fā)性骨髓瘤細胞株U266及RPMI8226的影響11-20
• 材料和方法11-16
• 結(jié)果16-18
• 討論18-20
• 第二部分：泊馬度胺聯(lián)合CAR-T對多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226、U266的體外殺傷作用20-27
• 材料和方法20-23
• 結(jié)果23-25
• 討論25-27
• 全文總結(jié)27-28
• 參考文獻28-30
• 綜述30-48
• 參考文獻44-48
• 科研成果48-49
• 致謝49

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