本文關(guān)鍵詞：MARVELD1與核仁素相互作用及其與DNA損傷關(guān)系的研究

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【摘要】：癌癥的發(fā)生與癌基因、抑癌基因以及其他相關(guān)基因具有十分密切的關(guān)系。MARVELD1基因是本實驗室在前期研究中發(fā)現(xiàn)的一個新的抑癌基因。MARVELD1(MARVEL domain containing 1)基因因含MARVEL(MAL and related proteins for vesicle trafficking and membrane link)結(jié)構(gòu)域,故定名為MARVELD1。研究結(jié)果表明,MARVELD1具有抑制腫瘤增殖并導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯等作用,與多種基因和蛋白具有相互作用。前期研究結(jié)果顯示,MARVELD1蛋白可能與核蛋白核仁素(Nucleolin,C23)具有相互作用。MARVELD1與核仁素均為定位于細(xì)胞核的蛋白,并且都參與了DNA損傷修復(fù)。本文以誘導(dǎo)DNA損傷為切入點,選用多種實驗方法從不同角度研究分析了MARVELD1與核仁素的相互作用情況及二者的關(guān)系。首先,本文采用人宮頸癌細(xì)胞系He La細(xì)胞完成了MARVELD1與核仁素的共定位分析,進(jìn)而,研究利用免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)和GST pull-down技術(shù)確認(rèn)了MARVELD1與核仁素的相互作用,并通過重組體技術(shù)構(gòu)建核仁素的重組截短體,明確了二者的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。隨后,本文采用Western Blotting技術(shù)探討MARVELD1與核仁素在誘導(dǎo)DNA損傷后的表達(dá)變化。最后,本文還通過亞細(xì)胞成分分離技術(shù)及si RNA干擾技術(shù),研究了MARVELD1對核仁素亞細(xì)胞定位的影響。結(jié)果表明,MARVELD1與核仁素在DNA損傷以后共定位非常明顯,二者確實具有相互作用,并且此相互作用在DNA損傷修復(fù)過程中有一個動態(tài)變化過程。MARVELD1與核仁素在DNA損傷修復(fù)過程中的表達(dá)趨勢不一致,核仁素表達(dá)增高時MARVELD1已經(jīng)開始表達(dá)下降。干擾MARVELD1結(jié)果表明,MARVELD1對核仁素亞細(xì)胞定位有一定影響。綜上所述,本文確認(rèn)了MARVELD1與核仁素的相互作用情況并明確了二者的結(jié)合結(jié)構(gòu)域,研究顯示了二者對DNA損傷都有明顯響應(yīng),說明MARVELD1與核仁素在DNA損傷修復(fù)過程中具有一定作用,且二者有一定相互作用關(guān)系,這種關(guān)系可能是通過MARVELD1影響核仁素的亞細(xì)胞定位來實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：MARVELD1 核仁素 DNA損傷修復(fù) 蛋白質(zhì)相互作用 亞細(xì)胞定位
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R730
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 第1章 緒論9-22
• 1.1 課題背景及目的和意義9-10
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及分析10-19
• 1.2.1 MAEVELD1 簡介10-11
• 1.2.2 核仁素簡介11-16
• 1.2.3 DNA損傷及修復(fù)簡介16-19
• 1.2.4 本文的研究假設(shè)19
• 1.3 主要研究內(nèi)容19-21
• 1.4 課題來源21-22
• 第2章 材料與方法22-35
• 2.1 實驗材料22-26
• 2.1.1 細(xì)胞系、載體及菌株22
• 2.1.2 抗體22-23
• 2.1.3 實驗試劑及材料23
• 2.1.4 試劑及配方23-25
• 2.1.5 實驗分析軟件25
• 2.1.6 PCR 擴(kuò)增引物及 RNAi 片段序列25
• 2.1.7 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.2 實驗方法26-35
• 2.2.1 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)26-27
• 2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染27
• 2.2.3 全細(xì)胞蛋白提取27-28
• 2.2.4 細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白提取28
• 2.2.5 RNA提取28
• 2.2.6 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA28-29
• 2.2.7 pGEX-4T-2/Nucleolin重組體構(gòu)建系列方法29-31
• 2.2.8 CaCl2 化學(xué)法感受態(tài)細(xì)胞制備31-32
• 2.2.9 GST融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)32
• 2.2.10 Western Blot免疫印記雜交32-33
• 2.2.11 免疫熒光實驗33
• 2.2.12 免疫共沉淀（Co-IP）33-34
• 2.2.13 GST-pulldown34-35
• 第3章 MARVELD1 與核仁素的相互作用分析35-45
• 3.1 引言35
• 3.2 GST-MARVELD1 與核仁素相互作用分析35-36
• 3.3 Co-IP檢測MARVELD1 與核仁素的相互作用36-38
• 3.3.1 MARVELD1 與核仁素免疫共沉淀36-37
• 3.3.2 核仁素與MARVELD1 免疫共沉淀37-38
• 3.4 GST-Nucleolin重組體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)38-42
• 3.4.1 pGEX-4T2Nucleolin重組體構(gòu)建38-39
• 3.4.2 pGEX-4T2Nucleolin重組體篩選及驗證39-40
• 3.4.3 重組子質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株及融合蛋白體外誘導(dǎo)表達(dá)40-42
• 3.5 GST-Nucleolin與MARVELD1 相互作用分析42
• 3.6 討論42-43
• 3.7 本章小結(jié)43-45
• 第4章 DNA損傷修復(fù)中MARVELD1 與核仁素的關(guān)系45-54
• 4.1 引言45
• 4.2 MARVELD1 與核仁素的共定位分析45-47
• 4.3 DNA損傷修復(fù)中MARVELD1 與核仁素的表達(dá)情況分析47-51
• 4.3.1 UV誘導(dǎo)后MARVELD1 與核仁素的表達(dá)47-48
• 4.3.2 射線（IR）照射后MARVELD1 與核仁素的表達(dá)48-49
• 4.3.3 Etoposide誘導(dǎo)后MARVELD1 與核仁素的表達(dá)49-50
• 4.3.4 UV及Etoposide聯(lián)合處理后MARVELD1 與核仁素的表達(dá)變化50-51
• 4.4 DNA損傷修復(fù)過程中MARVELD1 與核仁素結(jié)合情況變化51
• 4.5 討論51-53
• 4.6 本章小結(jié)53-54
• 第5章 MARVELD1 對核仁素亞細(xì)胞定位的影響54-58
• 5.1 引言54
• 5.2 DNA損傷時核仁素亞細(xì)胞定位的改變54-56
• 5.2.1 UV誘導(dǎo)后核仁素亞細(xì)胞定位的改變54-55
• 5.2.2 UV及Etoposide聯(lián)合處理后核仁素亞細(xì)胞定位的改變55-56
• 5.3 MARVELD1 表達(dá)沉默對核仁素亞細(xì)胞定位的影響56
• 5.4 討論56-57
• 5.5 本章小結(jié)57-58
• 結(jié)論58
• 展望58-59
• 參考文獻(xiàn)59-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64-66
• 致謝66

【引證文獻(xiàn)】

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 蒙國照;曾思恩;周英瓊;李運千;肖勝軍;;細(xì)胞表面核仁素表達(dá)下調(diào)抑制乳腺癌細(xì)胞生長[A];中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會2010年學(xué)術(shù)年會日程及論文匯編[C];2010年

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本文編號：714521