本文關(guān)鍵詞：Ad-pre-microRNA-193b重組腺病毒的構(gòu)建及其抗白血病效應(yīng)探討

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【摘要】：目的構(gòu)建microRNA-193b (miR-193b)前體Ad-pre-miR-193b重組腺病毒載體,并鑒定其在慢性粒細胞白血病細胞株K562中的表達水平,進一步探討高效表達miR-193b對K562細胞的抑制效應(yīng)及其作用機制,為后續(xù)研究miR-193b在CML動物模型中的抗白血病效應(yīng)提供實驗依據(jù)。方法1.化學合成miR-193b cDNA序列,克隆進入pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒,經(jīng)Pme I酶切線性化后轉(zhuǎn)入含腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)中進行同源重組,獲得pAd-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒,再經(jīng)PacI線性化后轉(zhuǎn)入HEK293細胞中包裝、擴增。收集病毒后感染K562細胞(設(shè)為Ad-pre-miR-193b組),同時設(shè)空白組(K562細胞組)及空載病毒組(Ad組),采用QRT-PCR檢測K562細胞中miR-193b基因的表達水平。2.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感染K562細胞,同時設(shè)空白組(K562細胞組)及空載病毒組(Ad組),采用QRT-PCR檢測miR-193b基因的表達水平；QRT-PCR和Western Blot分別檢測bcr/abl融合基因、BCR/ABL融合蛋白的表達水平；CCK-8法檢測K562細胞的增殖情況,流式細胞術(shù)(FCM)檢測K562細胞凋亡率。3.經(jīng)鑒定的Ad-pre-miR-193b重組腺病毒感染K562細胞后,采用Western Blot檢測凋亡蛋白caspase-3的表達水平。結(jié)果1. pAdTrack-CMV-pre-miR-193b重組穿梭質(zhì)粒和pAd-pre-miR-193b重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶鑒定及測序分析顯示構(gòu)建成功；重組腺病毒質(zhì)粒在HEK293細胞中包裝成功,并能夠高效轉(zhuǎn)染K562細胞；與對照組相比,QRT-PCR檢測顯示重組腺病毒載體感染K562細胞后其miR-193b基因表達水平明顯增加(P0.01)。2.與對照相比,K562細胞在感染Ad-pre-miR-193b重組腺病毒后,其miR-193b表達水平顯著升高；bcr/abl融合基因及BCR/ABL蛋白表達水平明顯下調(diào)(P0.05)；K562細胞增殖能力降低(P0.05)；K562細胞凋亡水平明顯上升(P＜0.05), caspase-3表達水平增高(P0.01)。結(jié)論1.成功構(gòu)建Ad-pre-miR-193b重組腺病毒,并能高效感染K562細胞,實現(xiàn)miR-193b基因在細胞內(nèi)的高效表達。2.高效表達的]miR-193b可下調(diào)慢粒白血病bcr/abl融合基因和BCR/ABL融合蛋白的表達水平,抑制K562細胞的生物學效應(yīng),提示高效表達miR-193b可成為治療CML的有效靶點,其作用機制可能通過上調(diào)凋亡蛋白caspase-3的表達,從而抑制K562細胞增殖,促進其凋亡。
【關(guān)鍵詞】：miR-193b K562細胞 bcr/abl caspase-3
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 第一部分 Ad-pre-miR-193b重組腺病毒的構(gòu)建及其表達鑒定15-32
• 1 材料與方法15-26
• 2 結(jié)果與分析26-30
• 3 討論30-32
• 第二部分 Ad-pre-miR-193b重組腺病毒的抗白血病效應(yīng)檢測及其機制探討32-44
• 1 材料與方法32-38
• 2 結(jié)果與分析38-42
• 3 討論42-44
• 參考文獻44-47
• 全文總結(jié)47-48
• 文獻綜述48-56
• 參考文獻53-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士研究生期間發(fā)表的文章57

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