本文關(guān)鍵詞：Bmi1干性肝癌細胞系的鑒定及其對肝癌膽管細胞樣表型轉(zhuǎn)變的影響

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【摘要】：研究背景和目的:肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在全球范圍內(nèi)具有極差的預后,這與肝癌極其復雜的腫瘤異質(zhì)性密切相關(guān)。近來研究發(fā)現(xiàn),肝癌的腫瘤異質(zhì)性主要由腫瘤細胞的干性分子決定,腫瘤細胞干性分子的表達決定了腫瘤的生物學特性,包括腫瘤細胞的增殖活性、侵襲轉(zhuǎn)移能力、化療抵抗以及對不同臨床治療方式產(chǎn)生的反應(yīng)。因此,如何對腫瘤不同的干性特征進行界定,可以為腫瘤異質(zhì)性提供理論基礎(chǔ),為腫瘤臨床的個體化治療及復發(fā)防治提供指導和策略。我們前期研究發(fā)現(xiàn),慢性肝臟疾病背景下肝前體細胞(Hepatic progenitor cell,HPC)活化與術(shù)后混合型肝癌的復發(fā)和預后顯著相關(guān),腫瘤的癌旁膽管反應(yīng)(Ductular reaction,DR)的增殖狀態(tài)(Proliferative index of ductular reaction,PIDR)與肝臟中肝前體細胞的活化具有顯著的正相關(guān)性,HPC活化可影響腫瘤內(nèi)一系列干性指標(EpCAM、CK7、CK19等)的表達(Hepatology,2012),提示癌旁的干性特征可影響到腫瘤的異質(zhì)性。因此,對癌及癌旁的干性特征進行界定,對于臨床預后判斷及分子分型具有重要意義。我們進一步在肝細胞癌和混合型肝癌的研究中還發(fā)現(xiàn),腫瘤內(nèi)協(xié)同出現(xiàn)EpCAM、Bmi1、CK7、CK19、Twist等干性分子表達時,隨著這些干性分子表達數(shù)量的增加,腫瘤可表現(xiàn)出更高的惡性程度,患者的預后更差,而對應(yīng)的腫瘤癌旁的PIDR、HPC也出現(xiàn)了更高的活化。提示這些分子表達的多少及數(shù)量可能影響到腫瘤的異質(zhì)性,并可將它們作為預后判斷及分子分型的重要依據(jù)。我們在腫瘤復發(fā)過程中也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。在腫瘤復發(fā)行多次手術(shù)的患者中,部分患者初次手術(shù)時腫瘤表現(xiàn)為Bmi1及EpCAM等多種干性分子共同表達的特征,其癌旁HPC活化顯著增強。令人感興趣的是,患者復發(fā)行二次手術(shù)時,腫瘤惡性程度與上述共表達干性分子密切相關(guān),有些患者還可出現(xiàn)病理類型的轉(zhuǎn)變,即由肝細胞癌轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝芗毎┗蚧旌闲透渭毎?膽管細胞癌。此外,我們研究還發(fā)現(xiàn)癌旁膽管反應(yīng)的增殖指數(shù)與干性分子bmi1的表達具有相關(guān)性,說明bmi1可在某種程度上影響hpc的活化狀態(tài),在hcc的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。鑒于此,本課題主要對上述研究中的關(guān)鍵分子bmi1在肝癌中的作用進行深入研究。干性分子bmi1廣泛參與細胞的增殖與分化,調(diào)控細胞衰老,從而改變細胞的生物學特性,并與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來,相關(guān)學者研究發(fā)現(xiàn)bmi1能夠通過介導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)的發(fā)生促進乳腺癌、鼻咽癌及前列腺癌等多種實體腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,從而影響患者的預后。那么,在高轉(zhuǎn)移復發(fā)率,較差的臨床預后的肝細胞癌中,干性分子bmi1與hcc的侵襲轉(zhuǎn)移是否相關(guān)呢,其具體作用及機制尚未明確,成為近年來研究肝癌轉(zhuǎn)移及預后的一個熱點。我們前期在對混合型肝癌的研究中發(fā)現(xiàn),癌旁hpc的活化與腫瘤內(nèi)ck7、ck19的表達呈正相關(guān),說明了hpc活化激活了腫瘤內(nèi)前體細胞/膽管細胞標記物的表達,使肝癌細胞獲得前體細胞/膽管細胞樣表型。另有學者研究發(fā)現(xiàn)hnf-1β能夠使肝癌細胞獲得但管細胞樣表型,表達膽管上皮標記物ck7及ck19,導致較差的預后,并且可能與患者術(shù)后病理亞型發(fā)生轉(zhuǎn)變相關(guān)。肝細胞癌,特別是一小部分肝癌亞型,能夠同時表達肝細胞標記物及膽管細胞標記物,而我們在臨床上也觀察到某些肝癌在術(shù)后復發(fā)可表現(xiàn)為不同的病理亞型,但是其中的具體機制尚未明確,成為我們本課題研究的一個方向。因此,本課題旨在分析:1.bmi1干性表達肝癌細胞系的功能鑒定及其機制研究;2.不同干性分子表達huh7肝癌細胞系的鑒定及其對肝癌膽管細胞樣表型轉(zhuǎn)變的影響。通過上述研究,以期對肝癌復雜的腫瘤異質(zhì)性及對腫瘤病理類型轉(zhuǎn)變的機制進行更深入的探討。研究方法及結(jié)果:第一部分:bmi1干性表達肝癌細胞系的功能鑒定及其機制研究。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建肝癌細胞系huh7及肝臟正常細胞系l02bmi1過表達細胞株以及肝癌細胞系smmc-7721bmi1干擾細胞株,觀察細胞株的生物學特性及侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。采用cck-8實驗檢測細胞株的增殖活性,5-fu處理后檢測細胞株化療耐藥性,克隆形成實驗檢測細胞集落形成能力,劃痕及transwell實驗檢測細胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。侵襲轉(zhuǎn)移機制研究中,利用real-timepcr與western-blot及細胞免疫熒光技術(shù)檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的分子標記物e-cadherin及vimentin的變化。結(jié)果顯示:1.干性分子bmi1能夠增強細胞株的增殖、耐藥性及克隆形成能力,改變細胞的生物學特性。2.過表達bmi1能夠增強細胞株的遷移侵襲性,real-timepcr與western-blot及細胞免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)其機制可能是通過emt促進細胞轉(zhuǎn)移。干擾肝癌細胞系bmi1表達后則出現(xiàn)相反的結(jié)果。第二部分:不同干性分子表達huh7肝癌細胞系的鑒定及其對肝癌膽管細胞樣表型轉(zhuǎn)變的影響。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別構(gòu)建肝癌細胞系huh7bmi1高表達、epcam高表達及bmi1和epcam共高表達細胞株。采用cck-8、集落形成、transwell及裸鼠皮下成瘤實驗檢測細胞株的干性特征。利用western-blot技術(shù)檢測emt標記物e-cadherin及vimentin的變化,同時檢測肝細胞標記物hnf4a及前體細胞/膽管細胞標記物ck19的表達情況。結(jié)果顯示:1.干性分子bmi1及epcam的表達能夠增強細胞的增殖、克隆形成及皮下成瘤能力,bmi1與epcam的共過表達可以明顯增強細胞的增殖、克隆形成及皮下成瘤能力。2.transwell實驗發(fā)現(xiàn)過表達bmi1細胞株與bmi1及epcam共過表達細胞株無顯著差異,但較過表達epcam細胞株具有明顯差異。進一步用western-blot實驗檢測emt標記物證實,過表達bmi1細胞株與bmi1及epcam共過表達細胞株發(fā)生emt,而過表達epcam細胞株并未出現(xiàn)此特征性改變。3.western-blot實驗檢測肝系膽系標記物發(fā)現(xiàn),不同干性表達的huh7細胞株肝系標記物hnf4a表達明顯下降,前體細胞/膽管細胞標記物ck19表達顯著升高。結(jié)論:干性分子bmi1的表達能夠影響肝癌細胞的生物學特性,通過介導emt的發(fā)生促進肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。肝癌細胞內(nèi)不同干性分子的表達能夠增強肝癌細胞的干性特征,干性分子激活越多,干性特征越強。細胞內(nèi)干性分子表達可使肝癌細胞獲得肝前體細胞/膽管細胞樣表型,能夠表達前體細胞/膽管細胞標記物,可能與腫瘤復發(fā)病理亞型轉(zhuǎn)變相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝細胞癌 Bmi1 干性 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 前體細胞/膽管細胞標記物
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-12
• 第一部分 BMI1干性表達肝癌細胞系的功能鑒定及其機制研究12-34
• 前言12-14
• 實驗方法14-20
• 實驗內(nèi)容20
• 實驗結(jié)果20-28
• 討論28-30
• 參考文獻30-34
• 第二部分 不同干性分子表達HUH7肝癌細胞系的鑒定及其對肝癌膽管細胞樣表型轉(zhuǎn)變的影響34-47
• 前言34-35
• 實驗方法35-37
• 實驗內(nèi)容37
• 實驗結(jié)果37-43
• 討論43-45
• 參考文獻45-47
• 綜述47-56
• 參考文獻51-56
• 附錄56-67
• 研究生期間公開發(fā)表的論著67
• 研究生期間參與的科研工作67-68
• 致謝68-70

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