本文關鍵詞：siRNA干擾Arf6對人前列腺癌PC-3細胞株增殖、遷移和侵襲的影響及分子機制研究

  更多相關文章： 前列腺癌 ADP核糖基化因子6 侵襲 遷移 RNA干擾

【摘要】：研究背景前列腺癌(prostate cancer,PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一,在歐美發(fā)達國家其發(fā)病率居男性惡性腫瘤首位,致死率居第二位。我國前列腺癌發(fā)病率雖然遠低于歐美國家,但隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展、生活方式和飲食結構的改變及人口老齡化社會的到來,前列腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)出快速持續(xù)上升的趨勢,1998-2008年間我國前列腺癌發(fā)病率年均增加比率達到了12.07%。自2008年起前列腺癌已成為我國泌尿生殖系統(tǒng)中發(fā)病率最高的腫瘤。在我國,早期局限性前列腺癌患者治療主要以前列腺癌根治術(Radical prostatectomy,RP)為主,患者5年生存率能達到90%以上。然而,大多數(shù)前列腺癌患者病情較隱匿,早期無癥狀或癥狀不明顯,且我國早期前列腺癌篩查尚未普及,因此,80-90%前列腺癌患者就診時就已經(jīng)是晚期前列腺癌,失去了手術治療的機會。晚期前列腺癌具有很強的轉移潛能,臨床上對于前列腺癌轉移主要采用雄激素去勢治療(Androgen Deprivation Therapy,ADT)。但大多數(shù)患者治療效果并不理想,預后較差,中位生存期僅為20個月左右。腫瘤轉移為臨床前列腺癌治療的主要障礙和患者死亡的主要原因。腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力的獲得是腫瘤實現(xiàn)遠處轉移的關鍵步驟,因此,研究與前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲相關的基因及分子作用機制,將為探索轉移性前列腺癌藥物治療新靶點提供新的實驗依據(jù)。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factor, Arf)是Ras基因超家族成員,因Arf能夠變構激活霍亂毒素,增強霍亂毒素的ADP-核糖基轉移酶活性,促進霍亂毒素對Gs蛋白α亞基ADP-核糖基化作用而被發(fā)現(xiàn)。ADP核糖基化因子6(ADP-ribosylation factor 6, Arf6)是Arf蛋白家族中最特殊的亞型,分子量約為20KD,主要分布于細胞膜和內(nèi)涵體膜。在細胞膜內(nèi)吞、胞外分泌、內(nèi)涵體循環(huán)、細胞分裂、微囊泡運輸和釋放、細胞間粘附連接的形成和肌動蛋白細胞骨架重構等方面發(fā)揮著關鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)Arf6高表達于乳腺癌、黑色素瘤和神經(jīng)膠質瘤等多種腫瘤組織和細胞中,并與腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲和轉移密切相關。盡管目前關于Arf6調(diào)節(jié)各類腫瘤細胞運動、侵襲和遷移的具體作用機制尚不明確,但近10年來研究顯示Arf6可能主要通過以下幾個方面影響腫瘤細胞的惡性生物學行為：①破壞腫瘤細胞間粘附連接的形成,促進腫瘤細胞侵襲性表型產(chǎn)生,增強腫瘤細胞運動和遷移能力；②調(diào)節(jié)腫瘤細胞肌動蛋白細胞骨架重構,促進與腫瘤細胞遷移和侵襲相關的細胞膜突觸結構形成,如板狀偽足(lamellipodia)、樹突狀偽足(invadopodia)、絲狀偽足(filopodia)、膜皺褶(membrane ruffles)和足體(podosome)等：③促進腫瘤細胞含各種蛋白水解酶的微囊泡的釋放,增強腫瘤細胞對胞外基質蛋白的降解能力。磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinases,PI3K)信號通路在細胞生長、存活、糖代謝、增殖、遷移和轉移等生物學活動中扮演者重要角色,P13K通過激活其下游信號通路關鍵分子絲/蘇氨酸蛋白激酶B (PKB/AKT),促進細胞增殖、遷移和轉移。研究發(fā)現(xiàn)Arf6調(diào)節(jié)膠質瘤細胞增殖與PI3K/AKT信號通路活化相關。胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族成員,參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、存活和凋亡。ERK磷酸化水平增加能夠增強腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。Arf6通過激活ERK信號通路能夠促進膠質瘤細胞增殖,采用siRNA干擾Arf6表達,下調(diào)ERK磷酸化水平能夠抑制細胞增殖。此外,在肝癌HepG2細胞中研究發(fā)現(xiàn)Arf6通過上調(diào)ERK磷酸化水平,激活下游效應蛋白Ras相關的C3肉毒素底物1(Ras-Related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)。 Racl是Rho家族成員,其表達增加能促進細胞運動和肌動蛋白細胞骨架重構,加速胞膜突觸和膜皺褶的形成,增強肝癌細胞遷移和侵襲能力。雖然很多研究表明Arf6和多種腫瘤的惡性生物學行為密切相關,但是目前尚未有報導前列腺癌細胞生物學行為與Arf6之間關系的研究。Arf6是否能夠調(diào)節(jié)前列腺癌細胞株增殖、侵襲和轉移及可能的作用機制,目前尚不清楚。研究目的本研究利用RNA干擾技術,下調(diào)Arf6表達,觀察Arf6對人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞株增殖、遷移和侵襲能力的影響,并初步探討其相關分子作用機制。研究方法1、Arf6 siRNA序列設計和干擾效果檢測：①根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Arf6基因序列(GenBank:NM_001663.3),由廣州銳博生物設計合成3條針對不同靶向區(qū)域的Arf6特異性siRNA(small interference RNA)序列,siRNA干擾序列分別為:siRNA-1(792-810), 5'-GGGACGCCAUAAUCCUCAUdTdT-3'(sense),5'-AUGAGGAUUAUGGCGU CCCdTdT-3'(antisense);siRNA-2(534-552),5'-CAACAAUCCUGUACAAGUUdT dT-3'(sense),5'-AACUUGUACAGGAUUGUUGdTdT-3'(antisense), and siRNA-3 (950-968),5'-CUCACAUGGUUAACCUCUAdTdT-3'(sense),5'-UAGAGGUUAA CCAUGUGAGdTdT-3'(anti-sense)。②取對數(shù)生長期前列腺癌PC-3細胞株,細胞生長融合度達60-70%時,采用Lipofectamin(?)2000將上述siRNA轉入前列腺癌PC-3細胞株內(nèi),并通過Real Time-PCR和蛋白質印跡(western blot)法分別檢測3條不同siRNA對PC-3細胞Arf6 mRNA和蛋白干擾效率,篩選出干擾效果最佳的siRNA序列；最后,采用同樣的方法確定該siRNA序列的最適作用濃度和作用時間。2、MTT法檢測細胞增殖：將細胞分為三組：siRNA-3組、陰性對照組(NC)和正常對照組(Con),采用噻唑鹽(MTT)法分別檢測siRNA-3轉染48、72和96小時后,各組PC-3細胞OD490 nm吸光度值,繪制生長曲線,并計算siRNA-3組細胞抑制率。細胞存活率(%)=[OD(實驗組)-OD(空白組)/OD(對照組)-OD(空白組)]×100%；細胞抑制率(%)=1-細胞存活率(%)。3、劃痕愈合實驗：取對數(shù)生長期的PC-3細胞接種至6孔細胞培養(yǎng)板,轉染siRNA 48小時形成單層細胞后,進行劃痕愈合實驗,用含1%FBS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后0h、6h、12h和18h進行拍照,每孔隨機選取5個視野,觀察細胞遷移距離和劃痕愈合率。細胞遷移距離=(劃痕寬度0h-劃痕寬度xh)/2；劃痕愈合率=[(劃痕區(qū)域面積0h-劃痕區(qū)域面積xh)/劃痕區(qū)域面積0h]×100%。4、Transwell侵襲實驗：采用未包被和包被Matrigel基質膠的Transwell小室檢測單個PC-3細胞遷移和侵襲能力。Transwell小室內(nèi)分別培養(yǎng)24和48小時后,取出小室4%多聚甲醛固定15分鐘,1%結晶紫染色10分鐘,PBS清洗風干后,顯微鏡下隨機選取5個視野進行細胞計數(shù)(100×)。5、Arf6信號通路相關蛋白的檢測：為了進一步探討siRNA-3干擾Arf6抑制前列腺癌細胞株增殖、遷移和侵襲可能的分子機制。我們采用蛋白質印跡法檢測了Arf6調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長和侵襲相關的PI3K/AKT和ERK/Rac1信號通路中關鍵信號分子AKT、p-AKT、ERK1/2、 p-ERK1/2和Rac1在各組PC-3細胞中的表達情況。6、統(tǒng)計學分析方法：各獨立實驗均重復3次,采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,兩兩比較用t檢驗,各組間的比較采用單因素方差分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果1、siRNA-3抑制前列腺癌PC-3細胞內(nèi)源性Arf mRNA和蛋白的表達①與空白對照組相比,轉染陰性對照序列對PC-3細胞內(nèi)源性Arf6的RNA和蛋白表達無明顯影響(P0.05)。3條特異性Arf6 siRNA靶向序列(siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3)均不同程度的抑制了PC-3細胞Arf6 RNA和蛋白的表達,其RNA抑制率分別為(34.82±4.79)%、(56.85±1.52)%和(91.88±3.13)%,蛋白抑制率分別為(25.73±1.25)%、(67.11±1.08)%和(86.37±0.57)%。其中siRNA-3對前列腺癌PC-3細胞內(nèi)源性Arf6干擾效果最好(P0.05)。②轉染不同濃度的siRNA-3(10nmol/L、20 nmol/L和50nmol/L)至PC-3細胞內(nèi),轉染48小時后,采用上述方法檢測不同濃度siRNA-3的干擾效果,結果發(fā)現(xiàn)siRNA-3(50nmol/L)能顯著抑制PC-3細胞內(nèi)源性Arf6的表達(P0.05),并且這種抑制效應能夠持續(xù)到細胞轉染后96小時,表明siRNA-3對PC-3細胞內(nèi)源性Arf6的抑制效應呈劑量和時間依賴性。2、siRNA-3干擾Arf6表達抑制前列腺癌PC-3細胞增殖利用噻唑鹽(MTT)法分別檢測siRNA-3、NC和Con組PC-3細胞siRNA轉染后不同時間點(48、72、96小時)的OD490 nm值,繪制細胞生長曲線,計算siRNA-3組細胞抑制率。siRNA-3轉染后不同時間點(48、72、96小時)對PC-3細胞抑制率分別為(10.68±0.04)%,(16.51±0.04)%和(26.35±0.03)%,與對照組相比均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。siRNA-3對PC-3細胞增殖的抑制在轉染96小時后最為顯著,并具有時間依賴性。3、siRNA-3干擾Arf6表達抑制PC-3細胞的遷移和侵襲能力①劃痕實驗檢測siRNA-3干擾Arf6表達對PC-3細胞遷移能力的影響,結果發(fā)現(xiàn)劃痕18小時后,Con和NC組PC-3細胞遷移距離和劃痕愈合率差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05),而siRNA-3組細胞遷移距離較對照組明顯減少(P0.001),而劃痕愈合率僅為對照組的45-50%(P0.05)。②Transwell體外遷移實驗結果顯示siRNA-3組穿過transwell小室的細胞數(shù)較對照組減少了61.61%(P0.05),而正常對照和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。Matrigel基質膠包被的transwell小室侵襲實驗結果顯示：siRNA-3組穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)較對照組減少了89.44%(P0.05),而正常對照組和陰性對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。表明siRNA-3干擾PC-3細胞內(nèi)源性Arf6表達能夠有效抑制細胞體外遷移和侵襲能力。4、 siRNA-3干擾Arf6表達抑制p-ERK1/2和Rac1表達蛋白質印跡法檢測結果顯示siRNA-3下調(diào)Arf6表達后,PC-3細胞內(nèi)p-ERK1/2和Rac1蛋白表達水平較對照組明顯降低,而AKT、p-AKT和ERK1/2蛋白表達水平較對照組差異無統(tǒng)計學意義。表明siRNA-3下調(diào)Arf6表達抑制PC-3細胞增殖、遷移和侵襲能力可能與p-ERK和Rac1表達下調(diào)相關。結論1、特異性siRNA-3能夠顯著抑制人雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞內(nèi)源性Arf6的mRNA和蛋白表達。2、Arf6表達下調(diào)后,前列腺癌PC-3細胞體外增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。3、Arf6表達下調(diào)抑制PC-3細胞增殖、遷移和侵襲,其可能與ERK1/2磷酸化和Rac1表達下調(diào)相關。
【關鍵詞】：前列腺癌 ADP核糖基化因子6 侵襲 遷移 RNA干擾
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-28
• 一、前列腺癌流行病學、診斷和治療現(xiàn)狀19-22
• 二、Arf發(fā)現(xiàn)、結構和分類22-23
• 三、Arf6的功能23-24
• 四、Arf6與腫瘤侵襲和遷移的關系24-25
• 五、PI3K/AKT信號通路與前列腺癌的關系25-26
• 六、ERK信號通路與前列腺癌的關系26-28
• 第一章 Arf6沉默對雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞株生物學功能影響的研究28-69
• 第一節(jié) siRNA對雄激素非依賴性前列腺癌PC-3細胞內(nèi)源性Arf6干擾效果的評價及篩選28-54
• 1.1 實驗材料和試劑28-34
• 1.2 實驗儀器和設備34-35
• 1.3 實驗方法35-48
• 1.4 實驗結果48-54
• 第二節(jié) siRNA-3干擾Arf6表達對前列腺癌PC-3細胞增殖的影響54-58
• 2.1 實驗材料和試劑54-55
• 2.2 實驗儀器和設備55-56
• 2.3 實驗方法56-57
• 2.4 實驗結果57-58
• 第三節(jié) siRNA-3干擾前列腺癌PC-3細胞內(nèi)源性Arf6表達對細胞遷移和侵襲能力的影響58-69
• 3.1 實驗材料和試劑59-60
• 3.2 實驗儀器和設備60
• 3.3 實驗方法60-64
• 3.4 實驗結果64-69
• 第二章 Arf6沉默影響前列腺癌PC-3細胞株生物學功能的分子作用機制研究69-77
• 1.1 實驗材料和試劑69-71
• 1.1.1 實驗材料69
• 1.1.2 實驗主要試劑69-71
• 1.2 實驗儀器和設備71-72
• 1.3 實驗方法72-74
• 1.4 實驗結果74-77
• 討論77-82
• 結論82-83
• 參考文獻83-91
• 綜述91-100
• 參考文獻96-100
• 縮略詞100-101
• 攻讀碩士學位期間參與發(fā)表的論文101-102
• 致謝102-103

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 單雄威;siRNA干擾Arf6對人前列腺癌PC-3細胞株增殖、遷移和侵襲的影響及分子機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2016年

，

本文編號：705290