本文關(guān)鍵詞：人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜初步篩選及研究

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【摘要】：目的:利用高通量長鏈非編碼RNA(Long noncoding RNAs,Lnc RNAs)芯片檢測胰腺癌親本細(xì)胞株SW1990及吉西他濱耐藥株SW1990/GZ的lnc RNA與m RNA表達(dá)譜變化,初步探索吉西他濱對SW1990細(xì)胞中l(wèi)nc RNA表達(dá)量的影響,并對差異表達(dá)的m RNA作進(jìn)一步的生物學(xué)信息分析,從新的角度探索胰腺癌耐藥發(fā)生的分子機(jī)制,從而為逆轉(zhuǎn)胰腺癌癌細(xì)胞耐藥治療提供新的靶點(diǎn)。方法:采用體外間歇濃度梯度遞增法構(gòu)建人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株SWl990/GZ;光學(xué)顯微鏡下觀察兩細(xì)胞形態(tài);MTT法檢測SWl990/GZ相對于其親本細(xì)胞SW1990的耐藥性和耐藥倍數(shù)、繪制生長曲線、計算倍增時間以及流式細(xì)胞儀分析SW1990及SWl990/GZ的細(xì)胞周期;運(yùn)用高通量lnc RNA芯片(Human Lnc RNA Microarray V2.0)比較胰腺癌耐藥細(xì)胞株SWl990/GZ與親本細(xì)胞SW1990之間lnc RNA和m RNA表達(dá)譜差異;對差異表達(dá)的m RNA行生物學(xué)信息分析;采用實(shí)時熒光定量PCR對差異表達(dá)譜中的6個lnc RNA(RP11-58D2.1,linc RNA-ZNF532,AP000221.1,CTC-338M12.5,CR619813,DDX6P)和9個m RNA(SYT1,FAM171B,ZNF331,FAM187B,CYP1A1,SRXN1,HIST1H2BL,TOMM40L,SPP1)進(jìn)行驗(yàn)證;將SW1990培養(yǎng)在含有吉西他濱濃度為1.5μM不同的時間(0,1,2,4,8,16 d)及將SW1990培養(yǎng)在不同濃度(0,1,2,4,8,16μM)吉西他濱培養(yǎng)基中24h,采用實(shí)時熒光定量PCR檢測SW1990細(xì)胞株linc RNA-ZNF532、DDX6P的表達(dá)量的變化情況。結(jié)果:1、成功建立了人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株SWl990/GZ,SWl990/GZ與SW1990同源。2、在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上,SWl990/GZ較SWl990發(fā)生了明顯改變;SW1990和SWl990/GZ對吉西他濱的IC50值分別為3.03±0.27μmol/L、230.46±0.31μmol/L,耐藥指數(shù)(RI)達(dá)到71.6,兩者比較有顯著差異(P㩳0.01)。CCK-8法測得SW1990/GZ比SW1990細(xì)胞的生長速度變慢,兩者的倍增時間分別為32.80±2.12h和22.36±1.78h(P㩳0.05)。與SW1990細(xì)胞相比,SW1990/GZ的G1細(xì)胞增多(P㩳0.05),G2期細(xì)胞減少(P㩳0.05),S期細(xì)胞比例無明顯差異(P0.05)。3、lnc RNA芯片結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ與親本細(xì)胞株的lnc RNA和m RNA表達(dá)差異顯著:lnc RNA中,2倍以上表達(dá)上調(diào)的lnc RNA為1993條,2倍以上表達(dá)下調(diào)的lnc RNA為2990條;m RNA中,2倍以上表達(dá)上調(diào)的m RNA為2671條,2倍以上表達(dá)下調(diào)的m RNA2088條,GO分析這些m RNA主要新陳代謝過程、細(xì)胞周期、分子粘合物、核苷酸結(jié)合物、激酶活性、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)等方面有關(guān)聯(lián),Pathway分析發(fā)現(xiàn)參與Toll-樣受體信號傳導(dǎo)途徑、小細(xì)胞肺癌、慢性粒細(xì)胞白血病、胰腺癌、DNA復(fù)制、膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌、P53通路、糖酵解/糖異生等調(diào)節(jié)通路。4、實(shí)時定量PCR結(jié)果顯示:與胰腺癌親本SW1990細(xì)胞相比,吉西他濱耐藥株SW1990/GZ中的lnc RNA基因:RP11-58D2.1(p0.01),linc RNA-ZNF532(p0.01),AP000221.1(p0.01)表達(dá)上調(diào),而lnc RNA基因:CTC-338M12.5(p0.05),CR619813(p0.05),DD-X6P(p0.01)表達(dá)下調(diào);與胰腺癌親本SW1990細(xì)胞相比,吉西他濱耐藥株SW1990/GZ中的m RNA基因:SYT1,FAM171B,ZNF331,FAM187B,CYP1A1表達(dá)上調(diào)(p0.01),而m RNA基因:SRXN1,HIST1H2BL,TOMM40L,SPP1表達(dá)下調(diào)(p0.01),q RT-PCR檢測結(jié)果與芯片結(jié)果是一致的。胰腺癌SW1990細(xì)胞中l(wèi)nc RNA(linc RNA-ZNF532、DDX6P)表達(dá)量受吉西他濱培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時間的影響。結(jié)論:1、成功的建立了人胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株SW1990/GZ,相對于親本細(xì)胞SW1990,其生物學(xué)特征發(fā)生了顯著改變;2、lnc RNA基因芯片是篩選胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株差異表達(dá)基因的一種理想有效的工具;3、首次采用用lnc RNA基因芯片表明在胰腺癌吉西他濱耐藥細(xì)胞株中存在異常表達(dá)的lnc RNA及m RNA基因,并運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR對異常表達(dá)的部分lnc RNA及m RNA基因進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步提高了芯片結(jié)果的可信度,生物學(xué)信息初步分析顯示這些異常表達(dá)m RNA可能在胰腺癌耐藥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用;4、胰腺癌SW1990細(xì)胞中l(wèi)nc RNA表達(dá)量受吉西他濱培養(yǎng)濃度及培養(yǎng)時間的影響,lnc RNA可能是胰腺癌化療耐藥潛在的基因治療靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：胰腺癌 吉西他濱 長鏈非編碼RNA 耐藥
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.9
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-14
• 材料與方法14-30
• 結(jié)果30-54
• 討論54-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-62
• 綜述62-71
• 參考文獻(xiàn)68-71
• 英文縮略詞表71-72
• 攻讀學(xué)位期間公開發(fā)表的論文72-73
• 致謝73-74

【參考文獻(xiàn)】

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1 Barbara Bournet;Marion Gayral;Jér，

本文編號：704025