本文關(guān)鍵詞：一種基于公共引物介導(dǎo)的白血病分子診斷技術(shù)研究

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【摘要】：目的:本課題利用公共引物介導(dǎo)的多重RT-PCR技術(shù),以常見的白血病融合基因作為檢測靶標(biāo),目的在于研究建立新型的、系統(tǒng)的、提高PCR檢測通量的方法體系,研發(fā)適用于臨床的常見白血病融合基因檢測試劑盒。方法:本課題包括設(shè)計公共引物的設(shè)計與鑒定、重疊延伸法構(gòu)建質(zhì)粒模板、多重檢測體系的建立和臨床樣本檢測。(1)用Primer Premier5.0軟件以非人基因組為模板進(jìn)行基礎(chǔ)公共引物的設(shè)計;采用NCBI網(wǎng)站Primer-blast功能進(jìn)行公共引物與人基因組、人c DNA的特異性的理論比對;理論設(shè)計和篩選的公共引物分別與人基因組和人c DNA進(jìn)行特異性溫度梯度PCR實驗驗證;將實驗驗證后的公共引物序列連接到人類一段GAPDH基因的兩端,插入到載體中構(gòu)建質(zhì)粒,利用含公共引物的質(zhì)粒模板檢測公共引物擴(kuò)增的敏感性;(2)文獻(xiàn)檢索和數(shù)據(jù)庫篩選本課題多重體系的白血病融合基因檢測靶標(biāo);通過重疊延伸法將位于人c DNA上不同位置的兩個基因片段通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得后連接在一起,插入載體構(gòu)建包含檢測靶標(biāo)融合基因的突變型質(zhì)粒模板:BCR/ABL e1a2型和e13a2型、PML/RARαL型和S型、E2A/PBX1 I型、AML1/ETO、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL和CBFβ/MYH11 A型,另有一包含SIL/TAL1型融合基因的質(zhì)粒模板通過直接合成法獲得;(3)利用Primer Premier5.0設(shè)計檢測靶標(biāo)基因特異性引物,將公共引物連接在靶標(biāo)特異引物的5’末端構(gòu)成嵌合引物,利用NCBI網(wǎng)站Primer-blast功能進(jìn)行嵌合引物的比對、修改和篩選,同時利用MFE2.0軟件進(jìn)行體系多重引物的比對和修改;本課題針對常見的白血病融合基因設(shè)計了2個多重檢測體系,體系1針對BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1融合基因型;體系2在體系1基礎(chǔ)上添加檢測靶標(biāo)E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1;通過構(gòu)建的包含白血病融合基因的突變型質(zhì)粒模板進(jìn)行體系特異性和敏感性檢測。將PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測后通過紫外凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果,進(jìn)行多重體系的構(gòu)建和優(yōu)化;(4)收集正常人及白血病患者的外周血,根據(jù)TRIzol一步抽提法獲得人total RNA,6隨機(jī)引物和MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得c DNA;采用本課題構(gòu)建的多重體系進(jìn)行臨床標(biāo)本的檢測,同時對比臨床檢測結(jié)果分析和評價公共引物介導(dǎo)的多重RT-PCR體系。結(jié)果:本課題成功建立了篩選公共引物的方法體系;設(shè)計了三對公共引物,通過與人基因組、人c DNA的理論和PCR實驗比對,結(jié)果均無產(chǎn)物;其中一對公共引物與包含公共引物序列的質(zhì)粒載體進(jìn)行敏感性PCR檢測時,檢測結(jié)果可達(dá)100個拷貝,選取該公共引物用于課題后期構(gòu)建多重檢測體系。采用重疊延伸技術(shù)成功構(gòu)建了十個包含白血病融合基因的突變型質(zhì)粒模板;本課題設(shè)計的兩個針對常見白血病融合基因的多重檢測體系均可特異、敏感地檢測白血病融合基因。體系1可有效檢測針對BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα和E2A/PBX1這4種融合基因的6個突變型質(zhì)粒模板,即BCR/ABL e1a2型、PML/RARαS型、E2A/PBX1 I型、BCR/ABL e13a2型、PML/RARαL型和AML1/ETO型,其敏感性檢測結(jié)果依次為103,102,102,10,103和102拷貝。體系2針對BCR/ABL、AML1/ETO、PML/RARα、E2A/PBX1、E2A/HLF、TEL/AML1、TEL/ABL、CBFβ/MYH11和SIL/TAL1這9種融合基因的11個突變型檢測模板,即BCR/ABL e13a2型、TEL/AML1型、BCR/ABLe1a2型、PML/RARα的L型、PML/RARαS型、AML1/ETO、E2A/PBX1 I型、E2A/HLF型、TEL/ABL型、CBFβ/MYH11A型和SIL/TAL1型,其敏感性檢測結(jié)果依次為:102,102,103,103,103,103,103,103,103,104,104拷貝。運(yùn)用這兩個多重體系對55例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測時,檢測結(jié)果均與醫(yī)院臨床診斷結(jié)果一致。結(jié)論:本課題構(gòu)建的基于公共引物介導(dǎo)的多重RT-PCR檢測體系可有效提高多重PCR檢測通量,對常見白血病融合基因的臨床診斷具有較高的敏感性和特異性。
【關(guān)鍵詞】：白血病 融合基因 RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 研究背景10-12
• 第一部分 公共引物的設(shè)計與鑒定12-30
• 研究材料12-14
• 1.主要儀器12-13
• 2.主要試劑13-14
• 3.相關(guān)生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站14
• 實驗方法14-22
• 1.主要試劑配置14-16
• 2.公共引物的設(shè)計16
• 3.內(nèi)參引物的設(shè)計16-17
• 4.公共引物的特異性檢測17-19
• 5.公共引物的敏感性檢測19-22
• 研究結(jié)果22-24
• 1.引物設(shè)計22-23
• 2.公共引物的特異性檢測23-24
• 3.公共引物的敏感性檢測24
• 討論24-26
• 參考文獻(xiàn)26-30
• 第二部分 多重檢測體系的設(shè)計與鑒定30-50
• 研究材料30-31
• 1.主要試劑30-31
• 2.相關(guān)生物信息學(xué)軟件及網(wǎng)站31
• 實驗方法31-39
• 1.重疊延伸法構(gòu)建質(zhì)粒模板31-35
• 2.體系特異引物和嵌合引物的設(shè)計35
• 3.多重檢測體系的構(gòu)建35-37
• 4.收集臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測37-39
• 研究結(jié)果39-50
• 1.文獻(xiàn)檢索結(jié)果39
• 2.重疊延伸法構(gòu)建質(zhì)粒模板39-42
• 3.體系特異引物和嵌合引物的設(shè)計42-44
• 4.基于公共引物的多重體系的特異性和敏感性檢測44-48
• 5.臨床標(biāo)本檢測結(jié)果48-50
• 討論50-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文、科研成果58-59
• 課題資助情況59-60
• 綜述60-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 附錄68-70
• 致謝70-71

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 管洪在;王海燕;喬宏;吳春梅;;兒童急性淋巴細(xì)胞白血病TEL基因微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測的臨床意義[J];青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2006年03期

2 王丹蕾;馬保根;張茵;翟亞萍;;白血病微小殘留病的分子生物學(xué)檢測[J];中華實用診斷與治療雜志;2009年10期

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本文編號：700984