本文關(guān)鍵詞：急性B淋巴細胞白血病差異miRNA綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學分析

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【摘要】：急性B淋巴細胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia, B-ALL)是種由B淋巴細胞在血液或骨髓中異常增殖引起的惡性血液疾病,是急性淋巴細胞白血病最常見的類型；主要發(fā)生在兒童,在成人中相對少見。近年來,基于危險度分層指導的治療,有85%B-ALL的兒童治愈,但有少部分未評為高風險的兒童治療后仍然復發(fā)；而且與兒童相比,成人B-ALL的生存率明顯低于40%。隨著全基因組遺傳分析技術(shù)等技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)B-ALL發(fā)病機制主要是染色體異常及基因表達異常,其中染色體異常包括染色體數(shù)目異常(如超二倍體、近單倍體和低亞二倍體等)和染色體結(jié)構(gòu)異常(如染色體異位t(9;22)(q34;q11.2) BCRABL1、t(12;21)(p13;q22) ETV6-RUNX1、t(1;19)(q23;p13) TCF3-PBX1和MLL基因重排；ATM.IKZF1和CDKN2A基因丟失等)；基因表達異常包括BCL2、 FLT3和HOXA等基因的異常表達。這些基因的功能及參與的生物學過程很多已被闡明,但在惡性轉(zhuǎn)換和多步發(fā)病中的調(diào)控機制還是知道得很少。至今,B-ALL的發(fā)病機制仍然未完全清楚。對發(fā)病機制的深入研究將有利于發(fā)展更先進的診斷及治療方法。基因表達的調(diào)控對于所有細胞穩(wěn)定性和維持性都是很必須的,而基因表達的調(diào)節(jié)異常是和多種惡性腫瘤的發(fā)病機制相關(guān)的。造血細胞的增長、分化和成熟的調(diào)控是個涉及多因素、多水平的復雜調(diào)控,包括了基因調(diào)控。它們以不同的調(diào)節(jié)方式共同調(diào)控造血細胞增殖、分化、遷移、歸巢和凋亡的全過程,以達到調(diào)控造血,維持正常造血平衡目的。造血干細胞、祖細胞增殖分化的各個環(huán)節(jié)都受到復雜的多基因調(diào)控。目前,大家公認的急性B淋巴細胞白血病是由多基因參與,并形成復雜的網(wǎng)絡(luò)共同作用的結(jié)果,其中微小、RNA(microRNA, miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)對基因表達的調(diào)控,是B-ALL復雜網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分�；蛐酒请S著人類基因組計劃快速發(fā)展起來的。它是具有高通量、高集成、微型化、平行化、多樣化和自動化等特點的分子生物學高新技術(shù)。隨著芯片技術(shù)的越來越發(fā)展,不同種類的芯片也應運而生。其中miRNA芯片的商業(yè)化發(fā)展以及越來越廣泛的應用,使得miRNA表達芯片已經(jīng)作為一種高通量,特異性、高敏感性的用來研究miRNA有力的工具,也是逐漸成為研究miRNA表達的最普遍和有效的檢測方法。隨著芯片數(shù)據(jù)的高速增長,需要對這些數(shù)據(jù)進行收集、存儲和管理,目前有GEO (Gene Expression Omnibus)、SMD (Stanford Microarray Database)、 ArrayEpress等與基因表達數(shù)據(jù)相關(guān)的公共數(shù)據(jù)庫：而且這些公共數(shù)據(jù)庫提供芯片數(shù)據(jù)的查詢、檢索以及下載。芯片數(shù)據(jù)的增長帶動了芯片數(shù)據(jù)分析軟件的發(fā)展,目前芯片數(shù)據(jù)分析軟件有公開免費的和商業(yè)化的,芯片數(shù)據(jù)分析軟件的應用為整個數(shù)據(jù)分析提供了很重要的幫助。隨著近些年來,大家對于miRNA的越來越深入的分析研究,促使了與miRNA相關(guān)的生物信息學得以迅速發(fā)展,形成很多與miRNA相關(guān)的數(shù)據(jù)庫和軟件,如有miRNA與靶基因的數(shù)據(jù)庫、miRNA與非編碼RNA的相互作用數(shù)據(jù)庫和miRNA與轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控關(guān)系的數(shù)據(jù)庫。這些與miRNA相關(guān)的生物信息學工具的發(fā)展,為我們此次研究構(gòu)建以miRNA為中心的綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學分析提供可能。因此,此次研究,我們是以芯片數(shù)據(jù)分析得到的差異niRNA為切入點,運用生物信息學方法綜合分析差異miRNA,用分析得到生物數(shù)據(jù)來構(gòu)建以差異miRNA為中心的綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而以系統(tǒng)水平去研究急性B淋巴細胞白血病的發(fā)病機理,為B-ALL的診斷和治療提供新的生物靶標具有非常重要的理論意義和迫切的現(xiàn)實意義。首先我們從NCBI (National Center for Biotechnology Information)的公共數(shù)據(jù)庫GEO中,下載了急性B淋巴細胞白血病的miRNA芯片數(shù)據(jù)GSE51908。以這GSE51908數(shù)據(jù)集為分析材料,利用Qlucore Omics Explorer 3.0軟件對GSE51908數(shù)據(jù)集進行差異表達niRNA的分析。接著對這些差異miRNAs進行了差異miRNAs與靶基因、長鏈非編碼RNA和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控關(guān)系的生物信息學分析。對差異miRNA進行靶基因分析,我們采用的是含有多個的預測軟件并且整合紫外交聯(lián)免疫共沉淀測序(corsslinking and immunoprecipitation sequencing, CLIP-Seq)及mRNA降解組測序(degradome sequencing, Degradome-Seq)數(shù)據(jù)來支持的miRNA靶標的數(shù)據(jù)庫StarBase和專門收錄實驗證明且整合其他類似數(shù)據(jù)庫的驗證數(shù)據(jù)庫MiRNATarBas的組合分析,對這些差異miRNAs靶基因進行準確全面的分析,總共獲得了631個miRNAs和靶基因的調(diào)控對。接著差異niRNA與長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)調(diào)控關(guān)系的分析,是利用整合108組CLIP-Seq的高通量測序?qū)嶒灁?shù)據(jù)能系統(tǒng)集中的鑒定miRNA與Target相互作用關(guān)系的StarBase v2.0軟件,得到了161個差異miRNAs與長鏈非編碼RNA的調(diào)控關(guān)系數(shù)據(jù)。然后我們采用了整理染色質(zhì)免疫共沉淀與二代測序(chromatin immunoprecipition with next-generation DNA sequencing, ChIP-seq)的高通量測序數(shù)據(jù)檢測出數(shù)以萬計的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(transcripition factor binding sites, TFBS)從而鑒定出轉(zhuǎn)錄因子(transcripition factor, TF)與miRNA調(diào)控關(guān)系的ChIPBase數(shù)據(jù)庫,進行了差異miRNAs與TF的調(diào)控關(guān)系的分析,得到了301個差異miRNAs與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控對。最后將這些差異miRNAs綜合多種生物信息學工具分析得到的差異miRNA與靶基因、差異miRNA與長鏈非編碼RNA以及差異miRNA與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控數(shù)據(jù)：用網(wǎng)絡(luò)可視化的cytoscape軟件來構(gòu)建以差異miRNA為中心的綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。接著對綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的進一步分析找出核心靶標；另外對一些差異miRNA調(diào)控的靶基因進行了生物學信息注釋數(shù)據(jù)庫(the database for annotation, visualization and integrated discovery, DAVID)中的KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析；再對核心靶標進行文獻挖掘等分析,繼而找出綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心差異miRNA 。通過上述的多種生物信息學工具的綜合分析,我們在急性B淋巴細胞白血病的GSE51908數(shù)據(jù)集中一共篩選出15個差異miRNAs,其中7個miRNAs表達上調(diào),8個miRNAs表達下調(diào)。再對綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行核心靶標分析,在綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中找到20個核心靶標,其中只有1個是長鏈非編碼RNA XIST,其余的19個全部都是轉(zhuǎn)錄因子,沒有核心靶標是屬于靶基因的。在核心靶標中PU.1轉(zhuǎn)錄因子,據(jù)文獻報道PU.1轉(zhuǎn)錄因子對造血干細胞譜系發(fā)育為淋巴系的選擇過程中起著重要的作用；其表達缺失可導致造血干細胞向淋巴系分化障礙；而且其表達紊亂可使血細胞發(fā)育受阻并引發(fā)人類急性白血病。這些PU.1研究結(jié)果,說明我們分析認為核心靶標在B-ALL的發(fā)生發(fā)展起到重要作用是相符合的。從綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖明顯得知,Hsa-miR-29a、hsa-miR-130a和hsa-miR-181c調(diào)控大量的長鏈非編碼RNA,包括核心靶標lncR XIST。對核心靶標XIST文獻分析顯示,XIST缺失會導致X染色體再激活(X-reactivation),誘導許多X連鎖基因(X-linked gene)異常表達,其包括了低表達的造血調(diào)控因子如FLT3基因。另外發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄因子陰陽子-1 (Ying yang-1, YY1)在XIST序列上有特異的結(jié)合位點,促使X染色體失活；hsa-miR-29a抑制YY1表達,而且高表達YY1和NFκB能解除hsa-miR-29a的抑制。因此我們認為：hsa-miR-29a通過與NFκB、 YY1相互作用負調(diào)控XIST對X染色體失活的調(diào)控,從而影響X-linked基因異常表達,參與急性B淋巴細胞白血病發(fā)生發(fā)展。據(jù)綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可知,Hsa-miR-181a-2、hsa-miR-181b-2和hsa-miR-663調(diào)控大量的轉(zhuǎn)錄因子,包括CDX2、YY1等。網(wǎng)絡(luò)分析可知,尾部相關(guān)的同源盒基因CDX2 (caudal- related homeobox transcription fact 2, CDX2)連接到11個差異miRNA,是最為核心靶標。而且發(fā)現(xiàn)核心靶標CDX2：轉(zhuǎn)錄因子CDX2調(diào)控hsa-miR-181,而CDX2基因作為hsa-miR-181靶基因,故hsa-miR-181與CDX2呈現(xiàn)反饋調(diào)控方式。對CDX2文獻挖掘,發(fā)現(xiàn)CDX2與急性白血病預后相關(guān),而且與Wnt通路相關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn),NLK基因是hsa-miR-181靶基因而且還是Wnt通路負調(diào)控因子。所以我們認為,hsa-miR-181通過與CDX2的反饋調(diào)控NLK基因?qū)nt通路調(diào)控,進而影響到B細胞增殖和凋亡。通過綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)可明顯看出,hsa-miR-126和hsa-miR-486-3p調(diào)控大量的靶基因。由于核心靶標沒有基因,故對hsa-miR-126和hsa-miR-486-3p靶基因進行通路分析,結(jié)果顯示hsa-miR-126靶基因富集到3條通路,其中Wnt信號通路P值小于0.05符合統(tǒng)計學意義,富集到Wnt通路的4個基因包括DVL3基因在內(nèi)。文獻發(fā)現(xiàn),DVL3基因轉(zhuǎn)錄翻譯成為Dishevelled蛋白。Dishevelled蛋白是Wnt通路重要蛋白,能將Wnt信號從受體傳遞到下游效應分子上。另外CDX2調(diào)控hsa-miR-126表達。故我們認為：hsa-miR-126通過DVL3基因負調(diào)控Wnt通路,而且hsa-miR-181可通過與CDX2調(diào)控hsa-miR-126對Wnt通路調(diào)控,從而影響B(tài)細胞增殖和凋亡。通過上述綜合的分析,我們得出了的結(jié)論是：hsa-miR-29a通過YY1負調(diào)控XIST對X染色體失活的調(diào)控,參與B-ALL發(fā)生發(fā)展。hsa-miR-181通過與CDX2調(diào)控NLK基因和hsa-miR-126,從而調(diào)控Wnt通路,影響B(tài)細胞增殖和凋亡。hsa-miR-29a、hsa-miR-126和hsa-miR-181家族是急性B淋巴細胞白血病的核心差異miRNA,在急性B淋巴細胞白血病的發(fā)生發(fā)展過程起到重要的作用；所以它們可能作為急性B淋巴細胞白血病潛在的治療靶點和診斷指標。
【關(guān)鍵詞】：急性B淋巴細胞白血病 差異表達miRNA 生物信息學 綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò) CDX2XIST
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R733.71
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 第一章 緒論15-30
• 1.1 急性B淋巴細胞白血病15-19
• 1.2 芯片的發(fā)展及應用19-22
• 1.3 miRNA相關(guān)的生物信息學的發(fā)展22-30
• 第二章 差異表達miRNA的生物信息學分析30-49
• 2.1 材料和方法30-37
• 2.2 結(jié)果37-49
• 第三章 差異miRNA綜合調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析49-60
• 3.1 材料與方法49-52
• 3.2 結(jié)果52-60
• 討論60-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-71
• 附錄71-74
• 成果74-75
• 致謝75-76

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本文編號：690140