本文關(guān)鍵詞：miR-1247-5p在原發(fā)性肝癌患者血清中的表達(dá)及靶向調(diào)控Smad2對肝癌細(xì)胞HepG2增殖與遷移的影響

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【摘要】：目的通過檢測臨床原發(fā)性肝癌患者的血清樣本中miR-1247-5p的表達(dá)水平,探討miR-1247-5p在原發(fā)性肝癌疾病診斷中的意義。驗(yàn)證miR-1247-5p對Smad2蛋白的靶向調(diào)控作用,觀察miR-1247-5p對HepG2細(xì)胞增殖、遷移能力的影響,探究miR-1247-5p在原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子調(diào)控機(jī)制。方法1.收集寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2014年4月至2015年2月期間臨床確診為原發(fā)性肝癌患者的血清樣本和同時(shí)期的健康體檢人群血清樣本共82例;Real-time PCR檢測,并利用相對定量法計(jì)算miR-1247-5p以及mi R-21在兩組人群的表達(dá)量。2.使用mi RBase,targetscan等軟件預(yù)測miR-1247-5p可能的靶向調(diào)控基因,選定TGF-?信號通路中的Smad2基因作為研究對象。針對Smad2基因3’非翻譯區(qū)(3’UTR)中與miR-1247-5p有靶向位點(diǎn)的核心作用序列和突變序列設(shè)計(jì)引物,并用PCR法進(jìn)行擴(kuò)增基因并克隆到雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒p MIR-Report載體中。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證miR-1247-5p對Smad2靶向作用;Western Blot檢測miR-1247-5p對Smad2蛋白表達(dá)水平的影響。3.將miR-1247-5p mimic、miR-1247-5p inhibitor、Smad2過表達(dá)載體以及Smad2 RNAi載體轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞中,以正常培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞作為空白對照,使用CCK-8試劑盒分別在0h、24h、48h、72h檢測細(xì)胞增殖情況;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(wound healing assays)檢測0h、24h、48h時(shí)的HepG2細(xì)胞遷移力變化。結(jié)果1.Real-Time PCR數(shù)據(jù)結(jié)果,與健康體檢人群相比,原發(fā)性肝癌患者血清中mir-21表達(dá)量上調(diào)3倍(0.01p0.05),mir-1247-5p表達(dá)量下調(diào)8倍(0.01p0.05)。通過roc曲線分析,mir-1247-5p對hcc的診斷具有一定的診斷價(jià)值。2.通過預(yù)測smad23'-utr與mir-1247-5p存在兩個(gè)潛在靶向位點(diǎn),位于smad2基因序列3390處(site1)和smad2基因序列4420處(site2),分別成功構(gòu)建兩個(gè)位點(diǎn)的report-smad23'-utr重組質(zhì)粒。熒光素酶檢測報(bào)告結(jié)果顯示,對位于基因序列3390處的靶向位點(diǎn),過表達(dá)mir-1247-5p可抑制smad2重組載體熒光素酶,抑制mir-1247-5p表達(dá)可使smad2重組載體熒光素酶升高(p0.05);對于基因序列4420處靶向位點(diǎn)而言,mir-1247-5p對smad2無明顯作用。westernblot實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染mir-1247-5pmimic組中smad2蛋白表達(dá)下調(diào)(p0.05);而轉(zhuǎn)染mir-1247-5pinhibitor組中,smad2蛋白表達(dá)上調(diào)(p0.05)。3.cck-8結(jié)果所示,smad2過表達(dá)組hepg2細(xì)胞的增殖率升高,mir-1247-5pmimic組可抑制hepg2細(xì)胞的增殖,共轉(zhuǎn)染mir-1247-5pmimic和smad2rnai也抑制了細(xì)胞的增殖;而共轉(zhuǎn)染mir-1247-5pmimic和smad2過表達(dá)質(zhì)粒后,細(xì)胞的增殖能力有所升高,表明在恢復(fù)smad2基因的表達(dá)后,可以有效的改變由mir-1247-5p對hepg2細(xì)胞所產(chǎn)生的增殖力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與初始0h相比較,在48h時(shí)mir-1247-5pmimic可使hepg2細(xì)胞遷移力降低,而過表達(dá)smad2組使肝癌細(xì)胞hepg2遷移力有所增高。結(jié)論1.與健康對照人群相比,原發(fā)性肝癌患者血清中mir-1247-5p表達(dá)有顯著性變化,血清中的mir-1247-5p對原發(fā)性肝癌的臨床診斷具有一定的參考意義,有望成為hcc潛在分子診斷靶標(biāo)。2.mir-1247-5p通過與smad23'-utr基因序列3390處(site1)位點(diǎn)結(jié)合,靶向抑制tgf-?信號通路的關(guān)鍵因子smad2的表達(dá),抑制肝癌細(xì)胞hepg2的增殖與遷移。3.研究結(jié)果為今后開發(fā)針對smad2為治療靶點(diǎn)的小rna分子藥物提供了理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：miR-1247-5p TGF-? Smad2 HepG2 原發(fā)性肝癌
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7;R730.43
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-17
• 第一部分 收集臨床HCC病人血清樣本，檢測miR12475p及miR-21表達(dá)量17-32
• 材料與方法17-24
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果24-29
• 討論29-32
• 第二部分 miR12475p對TGF-?信號通路中Smad2基因靶向調(diào)控作用32-50
• 材料與方法32-43
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果43-47
• 討論47-50
• 第三部分 miR12475p靶向Smad2對肝癌細(xì)胞HepG2的影響50-58
• 材料與方法50-53
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-56
• 討論56-58
• 結(jié)論58-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 綜述 microRNA與肝臟常見疾病關(guān)系的研究65-76
• 參考文獻(xiàn)72-76
• 致謝76-77
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的的學(xué)術(shù)論文77-78
• 個(gè)人簡歷78

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本文編號：686452