本文關(guān)鍵詞：c1orf109結(jié)合cyclin D1啟動子序列特征研究

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【摘要】：課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)了一種新型蛋白c1orf109。在之前的工作中,發(fā)現(xiàn)此蛋白本身存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn),是CK激酶的底物。細(xì)胞系蛋白水平分析結(jié)果則顯示c1orf109蛋白的水平在多個(gè)癌細(xì)胞系內(nèi)顯著增加,說明其表達(dá)與細(xì)胞的癌變進(jìn)程可能存在潛在聯(lián)系。在前期的co-IP實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)c1orf109蛋白具有與cyclin D1啟動子結(jié)合的能力。為了驗(yàn)證這種結(jié)合能力是否是c1orf109蛋白調(diào)控cyclin D1基因表達(dá)的途徑,從而是否能夠解釋c1orf109在細(xì)胞內(nèi)的水平和癌細(xì)胞增殖之間的關(guān)系,本研究主要研究了c1orf109對cyclin D1啟動子序列是否會產(chǎn)生作用并影響cyclin D1蛋白的表達(dá),以及這一作用若存在的情況下其在cyclin D1啟動子序列上的主要作用區(qū)域方面的內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)中首先使用了生物信息學(xué)手段對cyclin D1啟動子序列進(jìn)行了分析,并和已經(jīng)同c1orf109蛋白結(jié)合的序列區(qū)域進(jìn)行了對比,最終將cyclin D1啟動子分為了六個(gè)片段。這些cyclin D1啟動子片段隨后被連入PGL-3 basic熒光報(bào)告質(zhì)粒內(nèi),得到的重組質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染入He La細(xì)胞后,受內(nèi)源性c1orf109蛋白刺激表達(dá)了不同水平的熒光素酶。同時(shí)為了控制He La細(xì)胞內(nèi)的c1orf109蛋白的表達(dá)水平,實(shí)驗(yàn)使用了RNA干擾的方法,并通過western blot檢測發(fā)現(xiàn)所使用si RNA能夠降低細(xì)胞內(nèi)c1orf109蛋白的水平。最后,熒光報(bào)告重組質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染入通過si RNA干擾造成c1orf109水平不同的幾組He La細(xì)胞內(nèi),并檢測了熒光素酶的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組了-881-15bp和-316-15bp的熒光報(bào)告質(zhì)粒所表達(dá)的熒光素酶水平較高,且受c1orf109水平下降而出現(xiàn)的下降最為明顯。這些結(jié)果證明了c1orf109對cyclin D1基因表達(dá)上調(diào)的作用,并確定了這一過程的機(jī)理是通過c1orf109蛋白同cyclin D1啟動子序列的相互作用達(dá)成的。實(shí)驗(yàn)最終確定了c1orf109在cyclin D1啟動子序列上能夠產(chǎn)生作用的大致范圍,為進(jìn)一步明確這種調(diào)控表達(dá)的機(jī)制,并為闡明c1orf109作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件序列信息提供了線索。
【關(guān)鍵詞】：c1orf109 cyclin D1 啟動子 基因表達(dá)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R730.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-8
• 第1章 緒論8-20
• 1.1 研究背景8-9
• 1.2 研究現(xiàn)狀9-18
• 1.2.1 cyclin D1 的研究進(jìn)展9-12
• 1.2.2 c1orf109 功能和表達(dá)的研究12-13
• 1.2.3 轉(zhuǎn)錄因子與啟動子相互作用研究的主要手段和現(xiàn)狀13-18
• 1.3 本文的主要研究內(nèi)容18
• 1.4 技術(shù)路線18-20
• 第2章 實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)材料20-27
• 2.1 引言20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.2.1 細(xì)胞系20
• 2.2.2 菌株和重組體20-21
• 2.2.3 抗體21
• 2.2.4 常用緩沖液及其他試劑21-22
• 2.2.5 主要儀器設(shè)備22
• 2.2.6 主要軟件22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法22-26
• 2.3.1 啟動子序列分析22-23
• 2.3.2 PCR實(shí)驗(yàn)23
• 2.3.3 限制性內(nèi)切酶雙酶切實(shí)驗(yàn)23
• 2.3.4 DNA連接酶連接實(shí)驗(yàn)23
• 2.3.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)23
• 2.3.6 質(zhì)粒提取23-24
• 2.3.7 siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)24
• 2.3.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)24-25
• 2.3.9 瓊脂糖凝膠電泳25
• 2.3.10 細(xì)胞傳代培養(yǎng)25
• 2.3.11 細(xì)胞的裂解25
• 2.3.12 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)25-26
• 2.3.13 熒光素酶水平檢測26
• 2.4 本章小結(jié)26-27
• 第3章cyclin D1 啟動子重組質(zhì)粒的構(gòu)建27-38
• 3.1 引言27
• 3.2 cyclin D1 啟動子序列分析27-29
• 3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和篩選29-36
• 3.3.1 引物的設(shè)計(jì)29-32
• 3.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建32-34
• 3.3.3 重組質(zhì)粒的篩選34-36
• 3.4 重組質(zhì)粒表達(dá)熒光素酶效果的檢驗(yàn)36
• 3.5 本章小結(jié)36-38
• 第4章 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞熒光素酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)38-47
• 4.1 引言38
• 4.2 siRNA干擾c1orf109 蛋白表達(dá)水平38-40
• 4.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和熒光素酶的檢測40-45
• 4.4 本章小結(jié)45-47
• 結(jié)論47
• 展望47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 附錄53-58
• 致謝58

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 況守龍;胡廷章;;啟動子的克隆和研究方法[J];重慶工學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年01期

2 李志新;曹雙河;張相岐;張懷剛;;偽鵝觀草高分子量麥谷蛋白基因啟動子的克隆[J];長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)農(nóng)學(xué)卷;2007年02期

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4 郝迪，

本文編號：682526