本文關鍵詞：MTA1蛋白在人髓母細胞瘤的表達及調(diào)控侵襲轉移機制的研究

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【摘要】：研究背景：髓母細胞瘤(Medulloblastoma, MB)是兒童和青年最常見的惡性腦腫瘤之一,主要發(fā)生在后顱窩,常見于小腦蚓部或第四腦室,具有治愈率低、死亡率高、預后差的特點。髓母細胞瘤具有極強的浸潤性和轉移性,其腫瘤細胞可向臨近部位的腦組織浸潤、轉移,導致第四腦室閉塞進而引起顱內(nèi)壓增高的臨床癥狀；同時,腫瘤細胞也可通過腦脊液途徑沿硬脊膜下腔播散侵犯脊髓；另有研究表明,大約有5%的髓母細胞瘤也可轉移到長骨、肺等身體的其他部位。直以來,外科手術輔以放化療一直被認為是治療髓母細胞瘤主要方式,并且使得患者預后情況得到了明顯的改善,但髓母細胞瘤患者的5年總體生存率仍較低。因此,研究髓母細胞瘤侵襲和轉移的分子生物機制,對臨床探索出新的治療策略有著非常重要的意義。腫瘤轉移相關基因(Metastasis-Associated gene, MTA)是一個與腫瘤轉移密切相關的基因家族,可表達于腫瘤中,主要由3類基因(MTA1、MTA2、MTA3)6個亞型(MTA1、MTAls、MTA1-ZG29p、MTA2、 MTA3和MTA3L)組成。眾所周知,MTA蛋白的表達水平與腫瘤的侵襲性和腫瘤患者的預后情況有著密切的聯(lián)系。大量研究表明,MTA1通過影響蛋白質(zhì)的泛素化在調(diào)控蛋白的穩(wěn)定狀態(tài)、DNA損傷反應以及在人血液和上皮性惡性腫瘤中高表達狀態(tài)等發(fā)揮重要作用。另外,MTA1利用組蛋白去乙酰基和核小體重塑的方式調(diào)控上皮-間質(zhì)轉化、DNA損傷反應、腫瘤形成以及炎癥反應的作用也得到了證實。近年來,關于MTA1蛋白可能參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的報道越發(fā)增多。因此,MTA1蛋白有可能成為新的診斷和治療腫瘤的最佳通路和潛在治療靶點。本實驗,我們首先利用免疫組化明確MTA1在人髓母細胞瘤及瘤旁正常組織中的差異表達,然后通過RT-PCR,粘附實驗等方式明確MTA1在在髓母細胞瘤的侵襲和轉移的作用,為臨床治療髓母細胞瘤提供新思路。目的：探討腫瘤轉移相關基因(Metastasis-associated gene 1, MTA1)在髓母細胞瘤(Medulloblastoma, MB)中侵襲、轉移的作用及其機制。方法：標本收集：收集南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院神經(jīng)外科和東莞市人民醫(yī)院神經(jīng)外科從2010年12月至2014年12月收治的手術切除和病理確診的29例髓母細胞瘤患者中,女性14例(48.3%),男性15例(51.7%),年齡：5-36年,平均年齡14.17±8.17歲。納入標準：(1)臨床資料完整；(2)病理診斷確定為髓母細胞瘤；(3)術中獲取的腫瘤組織及瘤旁正常組織分別作為實驗組與對照組。排除標準： (1)患者臨床資料不完整；(2)伴有其它的原發(fā)腫瘤。每例患者的標本離體后立即用10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋,作4μm連續(xù)切片供檢測用。免疫組織化學染色檢測MTA1蛋白表達：采用免疫組織化學法檢測所有標本中MTA1蛋白表達水平,具體步驟按說明書操作,手術切術的腫瘤組織及瘤旁正常組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后,石蠟包埋切片常規(guī)脫蠟水化,采用枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)、0.3% H202分別進行抗原修復和阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性,然后滴加按1：200稀釋后的鼠抗人MTA1多克隆抗體并4℃孵育過夜,第2天取出室溫恢復30 min, PBS清洗后,滴加兔抗鼠二抗并37℃作用30 min,PBS清洗后,DAB染色,復染后封片,同時我們以PBS代替一抗作陰性對照；結果,以瘤細胞中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞,并根據(jù)雙評分半定量方法進行評分：染色強度(無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色或棕褐色為2分),陽性細胞百分比(陰性為0分,20%為1分,20%-50%為2分,50%為3分),而且染色強度評分加陽性細胞百分比評分所得結果≥2時,即為免疫反應(+),否則為(.)。MTA1-siRNA轉染Daoy細胞：我們從ATCC公司購得髓母細胞瘤Daoy細胞株,同時化學合成針對MTA1的小干擾序列即siRNA、無義對照序列niRNA、質(zhì)粒載體Lipofectamine 2000,將Daoy置于DMEM培養(yǎng)基中,37℃、5%的CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,通過Lipofectamine 2000將化學合成的MTA1-siRNA及無義序列MTA1-niRNA轉染Daoy細胞內(nèi),恒溫箱內(nèi)孵育48-96 h,同時以轉染質(zhì)粒載體作為空白對照組。RT-PCR檢測MTA1 mRNA表達：Trizol法提取總RNA,利用紫外分光光度計(Qcontums)測純度和濃度,取2μ.g總RNA,用逆轉錄酶進行反轉錄,取cDNA5μL作PCR擴增,94℃變性30 s,55℃退火40 s,72℃延長30s,擴增長度為210bp,最后利用凝膠電泳后分析結果,以MTA1和P-actin擴增帶的吸光度比值來評價MTA1 mRNA的表達水平。Western blot檢測MTA1蛋白表達：收集各組細胞,提取細胞蛋白、上樣,通過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品后轉膜,室溫封閉后加入稀釋濃度為1：200的羊抗人MTA1多克隆抗體,4℃孵育過夜后,加入相應二抗,孵育、暗室曝光、顯影、定影及分析,其中我們以β-actin作為內(nèi)參標志物。細胞粘附能力實驗：待轉染48h后,將對數(shù)期生長的Daoy細胞利用胰蛋白酶消化法制成單細胞懸液,然后接種于Matrigel膠預處理的96孔板中,每孔加1×105細胞,并設3個平行孔,分別在孵育30min、60min、90min后用PBS洗滌以除去未黏附的細胞,采用噻唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium, MTT)比色法檢測570nm處的吸光度(A)值并計算粘附率,其公式為粘附率(%)=粘附于Matrigel上細胞的A值/總細胞A值×100%。細胞劃痕實驗：待轉染48h后,將對數(shù)期生長的Daoy細胞利用胰蛋白酶消化法制成單細胞懸液并接種于6孔培養(yǎng)板中,待細胞長到完全融合時,用200μL黃色槍頭在6孔板的底面上沿直線輕輕劃痕制作細胞傷口模型,PBS沖洗2次后繼續(xù)培養(yǎng),分別于劃痕后第8h、16h、24h后在倒置顯微鏡下觀察細胞劃痕愈合情況并拍照。我們以細胞劃痕愈合百分比表示細胞的遷移能力(0h的細胞劃痕愈合為0%)。Transwell小室體外侵襲實驗：將Transwell小室置于24孔板內(nèi),在每個下室內(nèi)加入含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液500μL,上室加入200μL細胞懸液,每組設5個復孔,常規(guī)培養(yǎng)12h后取出Transwell小室,利用95%乙醇固定并采用棉拭子擦去小室內(nèi)面的基質(zhì)腔,然后通過4%多聚甲醛固定、HE染色,最后在顯微鏡下觀察并拍照。統(tǒng)計分析：應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理分析,計量資料以均數(shù)±標準差表示。兩組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,多組數(shù)據(jù)間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA分析。計數(shù)資料以用百分比/率表示,比較采用卡方檢驗。全部數(shù)據(jù)均進行雙邊檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結果：1.MTA1蛋白在髓母細胞瘤組織中的陽性表達率高于瘤旁正常組織的陽性表達率(P0.01)；2.MTA1-siRNA組中MTA1的表達水平較MTA1-niRNA組及對照組明顯降低(均P0.05)；3.MTA1-siRNA組中MTA1蛋白量的表達顯著低于MTA1-niRNA組及對照組(P0.05),而MTA1-niRNA組和對照組的MTA1蛋白表達量無明顯差異(P0.05)；4.MTA1-siRNA組中細胞黏附率顯著低于MTA1-niRNA處理組及對照組細胞黏附率(P0.05),而對照組及MTA1-niRNA組細胞粘附率差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；5.與對照組及MTA1-niRNA組相比,MTA1-siRNA組細胞的劃痕愈合速度較慢,并出現(xiàn)未完全愈合現(xiàn)象；6.MTA1-siRNA組中穿過Transwell小室基底膜細胞數(shù)量明顯低于MTA1-niRNA組及對照組(P0.05),而對照組和MTA1-niRNA處理組穿過基底膜細胞數(shù)目之間無明顯差異(P0.05)。結論：髓母細胞瘤中MTA1蛋白表達水平升高,而且,抑制MTA1的表達可以降低髓母細胞瘤細胞的轉移、侵襲及黏附能力。因此,MTA1可作為臨床上治療人髓母細胞瘤潛在的靶點。
【關鍵詞】：腫瘤轉移相關蛋白1 髓母細胞瘤 轉移 侵襲 黏附 小干擾RNA
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.4
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-19
• 第一部分 MTA1蛋白在人髓母細胞瘤的表達19-26
• 1.1 實驗儀器、材料和試劑19-21
• 1.2 實驗方法21-23
• 1.3 結果23
• 1.4 附圖23-26
• 第二部分 MTA1蛋白調(diào)控髓母細胞瘤侵襲轉移機制的研究26-45
• 2.1 實驗儀器、材料和試劑26-30
• 2.2 實驗方法30-38
• 2.3 結果38-40
• 2.4 附圖40-45
• 討論45-52
• 結論52-53
• 參考文獻53-58
• 綜述58-66
• 參考文獻62-66
• 中英文縮略詞對照表66-67
• 攻讀學位期間成果67-68
• 致謝68-69

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本文編號：678257