本文關(guān)鍵詞：組蛋白去甲基化酶RBP2在人胃癌血管生成中的關(guān)鍵作用

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【摘要】：研究目的：在世界范圍內(nèi),胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,在胃癌的癌變過程中,遺傳和表觀遺傳的改變可以導(dǎo)致癌癥的漸進(jìn)轉(zhuǎn)化。本文研究了組蛋白去甲基化酶RBP2對(duì)人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的調(diào)控機(jī)制,從而豐富了RBP2參與腫瘤惡性進(jìn)展和血管生成的機(jī)制,確定這一分子機(jī)制對(duì)胃癌的診斷和治療有一定潛在作用。研究方法：1、在組織水平上,用實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了27對(duì)(胃癌組織和癌旁正常組織)標(biāo)本中RBP2、VEGF的水平,通過對(duì)比RBP2和VEGF在胃癌和癌旁組織中的表達(dá)水平,初步確定兩者之間的正相關(guān)性。我們還在這些組織中檢測(cè)了表征微血管密度(MVD)的標(biāo)志物CD31和CD34、表征細(xì)胞增殖的標(biāo)志物Ki67,進(jìn)一步分析了RBP2與這幾個(gè)分子之間的相關(guān)性。2、在分子水平上,我們利用RBP2的高表達(dá)質(zhì)粒和RBP2的小干擾RNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞系,檢測(cè)其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的影響,同時(shí)我們檢測(cè)了高表達(dá)和干擾RBP2分子對(duì)細(xì)胞內(nèi)H3K4me2和H3K4me3表達(dá)水平的影響。我們又發(fā)現(xiàn)在VEGF的啟動(dòng)子區(qū)包含有RBP2的調(diào)控下游基因表達(dá)的靶序列CCGCCC,我們構(gòu)建了VEGF的啟動(dòng)子質(zhì)粒和突變質(zhì)粒,通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了RBP2可以通過VEGF啟動(dòng)子區(qū)序列CCGCCC直接結(jié)合到VEGF的啟動(dòng)子區(qū)。我們又檢測(cè)了高表達(dá)和干擾RBP2處理后,胃癌細(xì)胞系的克隆形成能力和其條件培養(yǎng)基對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)微管形成能力的影響。3、在動(dòng)物水平,我們首先取野生型小鼠、雜合RBP2敲除鼠、純合RBP2敲除鼠的胃部組織,通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組化的方法,檢測(cè)VEGF的mRNA水平和蛋白水平的變化。然后我們?cè)诼闶笃は伦⑸銻BP2穩(wěn)定干擾的胃癌細(xì)胞系BGC-823,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤的形成和體積變化,15天后麻醉處死,分離瘤組織,通過Western Blotting的方法檢測(cè)RBP2的敲除效果,利用免疫組化檢測(cè)VEGF、CD31、CD34 和 Ki67的表達(dá)水平。結(jié)果：1、與正常組織相比,胃癌組織中RBP2和VEGF均高表達(dá),微血管密度(MVD)和細(xì)胞增殖也更明顯。2、在胃癌上皮細(xì)胞系中高表達(dá)RBP2之后,VEGF的mRNA水平和蛋白水平有明顯的升高,干擾RBP2有相反的效果。3、在野生型小鼠、雜合RBP2敲除鼠、純合RBP2敲除鼠的胃部組織中,檢測(cè)VEGF的mRNA水平和蛋白水平的變化呈逐步降低的趨勢(shì),CD31、CD34和Ki67也呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì),說明敲除RBP2對(duì)血管形成和細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用。4、通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)證實(shí)了RBP2可以通過CCGCCC序列直接結(jié)合到VEGF的啟動(dòng)子區(qū),進(jìn)而作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控VEGF的表達(dá)水平。5、在胃癌上皮細(xì)胞系中,通過克隆形成實(shí)驗(yàn)及回復(fù)實(shí)驗(yàn),證實(shí)RBP2表達(dá)顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞的克隆形成能力；通過微管形成實(shí)驗(yàn)證實(shí),高表達(dá)RBP2細(xì)胞的條件培養(yǎng)基可以顯著誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的微管形成。6、裸鼠皮下注射RBP2穩(wěn)定干擾的BGC-823細(xì)胞,通過對(duì)瘤體體積的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),RBP2的敲除可以顯著抑制胃癌細(xì)胞的裸鼠皮下成瘤能力；通過對(duì)瘤體的免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn),和對(duì)照組相比,RBP2穩(wěn)定干擾組的VEGF、CD31、CD34.Ki67蛋白的表達(dá)水平均降低,表明在整體動(dòng)物水平,RBP2的穩(wěn)定干擾可以降低微血管密度,抑制腫瘤細(xì)胞增殖,從而證明RBP2對(duì)VEGF的調(diào)控作用。結(jié)論：RBP2可以促進(jìn)胃癌腫瘤發(fā)生和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá),并促進(jìn)血管生成。RBP2和活化的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的過度表達(dá)可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：RBP2 VEGF 胃癌 血管生成
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.2
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符號(hào)說明10-11
• 前言11-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-19
• 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-32
• 討論32-35
• 結(jié)論35-36
• 附圖表36-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 致謝51-52
• 發(fā)表文章情況52-53
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況53

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