本文關(guān)鍵詞：抗腫瘤溶栓嵌合蛋白制備與生物活性研究

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【摘要】：腫瘤患者的常見并發(fā)癥之一是血栓。腫瘤發(fā)生與血栓形成的關(guān)系比較密切,血栓在腫瘤血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移等機(jī)制中起著重要作用,腫瘤并發(fā)血栓被稱為Trousseau綜合癥。惡性腫瘤患者中血栓發(fā)生率約為10%-30%,臨床研究表明,血栓是目前癌癥患者第二死亡原因,血栓可謂腫瘤患者的隱形殺手。因此,腫瘤并發(fā)血栓是一個(gè)不容忽視的問題。金葡球菌腸毒素C2(staphylococcal enterotoxins, SEC2)是由金葡球菌分泌的一種細(xì)菌性超抗原,臨床上對肺癌、胃癌、卵巢癌、膀胱癌等惡性腫瘤均表現(xiàn)出良好的治療效果。葡激酶(staphylokinase, Sak)是金葡球菌分泌的另一種重要蛋白,具有溶栓活力強(qiáng)、溶栓作用專一、過敏反應(yīng)少及可以有效避免出血反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室已將天然SEC2的N端和C端進(jìn)行改造,分別剔除了N端17個(gè)氨基酸和C端的132個(gè)氨基酸,分析得出該突變體△SEC2的超抗原活性得已保留,且降低了天然SEC2的免疫原性；類似的,實(shí)驗(yàn)室還構(gòu)建出缺失了N端10個(gè)氨基酸但溶栓活性不變的葡激酶突變體蛋白,并將它與突變體△SEC2基因進(jìn)行嵌合,分別得到了嵌合蛋白△Sak-△SEC2和△SEC2-ASak。以實(shí)驗(yàn)室前期研究為基礎(chǔ),對抗腫瘤溶栓嵌合蛋白制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,對重組大腸桿菌的培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化,并對其超抗原活性進(jìn)行深入研究,利用嵌合蛋白結(jié)合組織相容性復(fù)合體ⅡⅡ分子(major histocompatibility complex, MHCⅡ)能力研究、體外促淋巴細(xì)胞增值實(shí)驗(yàn)、體外抑瘤實(shí)驗(yàn)、小鼠體內(nèi)腫瘤抑制實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究抗腫瘤溶栓嵌合蛋白的活性。研究結(jié)果如下：1)嵌合蛋白制備條件優(yōu)化以裝液量、接菌量和初始pH值三因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),確定其最佳培養(yǎng)條件；以誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度三因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn),確定其最佳誘導(dǎo)條件。結(jié)果表明：抗腫瘤溶栓嵌合蛋白制備工藝的最佳培養(yǎng)條件是裝液量100m1、接種量2%、初始pH值7.5,最佳誘導(dǎo)條件是誘導(dǎo)時(shí)間4h、誘導(dǎo)溫度33℃、誘導(dǎo)劑濃度0.6mM。2)嵌合蛋白結(jié)合MHCⅡ分子能力研究制備得到的嵌合蛋白與癌細(xì)胞表面的MHCⅡ分子作用,在不同蛋白濃度和不同時(shí)間的條件下比較得出嵌合蛋白可能與MHCⅡ分子的結(jié)合能力隨著蛋白濃度的增大而增強(qiáng),且與SEC2無明顯差異,但結(jié)合能力與時(shí)間沒有關(guān)系。3)體外生物學(xué)活性分析得到純化蛋白后進(jìn)行活性的分析與檢測。根據(jù)研究的目的主要分析嵌合蛋白以下幾個(gè)生物學(xué)活性：蛋白體外抑制腫瘤細(xì)胞生長活性、促進(jìn)PBMC細(xì)胞增殖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,嵌合蛋白保留了SEC2的體外促淋巴細(xì)胞增殖活力和抑制胃癌、結(jié)腸癌、白血病的活性。抑制腫瘤的活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的活性都是隨著蛋白濃度的增大而增強(qiáng),且與SEC2無明顯差異。4)體內(nèi)抗腫瘤活性分析采用小鼠移植瘤模型,對抗腫瘤溶栓嵌合蛋白抗腫瘤的作用進(jìn)行研究,以進(jìn)一步揭示抗腫瘤溶栓嵌合蛋白在腫瘤治療方面的意義。構(gòu)建小鼠S180肉瘤移植瘤模型,分別腹腔注射高、中、低劑量(100、50、10μg/ml)的抗腫瘤溶栓嵌合蛋白,連續(xù)給藥8d,同時(shí)以SEC2為陽性對照,PBS為陰性對照。于給藥后第9天處死小鼠,將腫瘤組織分離并稱重。結(jié)果表明,抗腫瘤溶栓嵌合蛋白能夠顯著降低8180荷瘤小鼠平均瘤重,與陰性對照組比較具有顯著性差異,抗腫瘤溶栓嵌合蛋白能明顯延長S180荷瘤小鼠的生存時(shí)間,顯著提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和肝指數(shù)。綜上所述,本研究能夠提高抗腫瘤溶栓嵌合蛋白的表達(dá)量,證明了抗腫瘤溶栓嵌合蛋白無論在體外還是體內(nèi)都具有較好的超抗原活性。該研究將對于治療腫瘤并發(fā)血栓具有重要意義,將可能成為新型治療藥物并為其進(jìn)一步的研究和開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Trousseau綜合癥 嵌合蛋白 制備 生物活性
【學(xué)位授予單位】：遼寧大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 前言13-18
• 0.1 惡性腫瘤并發(fā)血栓13-14
• 0.1.1 惡性腫瘤并發(fā)血栓形成的機(jī)制13-14
• 0.1.2 腫瘤并發(fā)血栓形成的治療14
• 0.2 金黃色葡萄球菌腸毒素C2超抗原14-16
• 0.2.1 金黃色葡萄球菌14-15
• 0.2.2 金黃色葡萄球菌腸毒素C215
• 0.2.3 SEC2的抗腫瘤機(jī)制15-16
• 0.2.4 SEC2缺失突變體16
• 0.3 金黃色葡萄球菌激酶16-17
• 0.3.1 Sak的溶栓作用機(jī)制16-17
• 0.3.2 Sak缺失突變體17
• 0.4 實(shí)驗(yàn)室前期研究17
• 0.5 研究目的和意義17-18
• 第1章 嵌合蛋白制備條件優(yōu)化18-26
• 1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>18
• 1.2 方案設(shè)計(jì)與分析18
• 1.3 實(shí)驗(yàn)材料與試劑18-21
• 1.3.1 實(shí)驗(yàn)菌種18-19
• 1.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-20
• 1.3.3 儀器與設(shè)備20
• 1.3.4 常用培養(yǎng)基配置20-21
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法21-22
• 1.4.1 菌株的活化21
• 1.4.2 重組大腸桿菌培養(yǎng)條件優(yōu)化21
• 1.4.3 抗腫瘤溶栓嵌合蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化21-22
• 1.5 結(jié)果與討論22-25
• 1.5.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果22-24
• 1.5.2 誘導(dǎo)條件優(yōu)化結(jié)果24-25
• 1.6 分析與討論25-26
• 第2章 嵌合蛋白結(jié)合MHC Ⅱ類分子能力研究26-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>26
• 2.2 方案設(shè)計(jì)與分析26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)材料和試劑26-29
• 2.3.1 實(shí)驗(yàn)菌株和細(xì)胞26
• 2.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑26-27
• 2.3.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備27
• 2.3.4 實(shí)驗(yàn)試劑配制27-29
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 2.4.1 抗腫瘤溶栓嵌合蛋白制備29-30
• 2.4.2 蛋白樣品測定30
• 2.4.3 Western blot方法檢測嵌合蛋白結(jié)合MHC Ⅱ類分子能力30-32
• 2.5 結(jié)果32-33
• 2.6 分析與討論33-34
• 第3章 嵌合蛋白體外活性研究34-43
• 3.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>34
• 3.2 方案設(shè)計(jì)與分析34
• 3.3 實(shí)驗(yàn)材料和試劑34-36
• 3.3.1 細(xì)胞系34-35
• 3.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑35
• 3.3.3 儀器與設(shè)備35
• 3.3.4 細(xì)胞培養(yǎng)溶液的配置35-36
• 3.4 實(shí)驗(yàn)方法36-40
• 3.4.1 細(xì)胞的復(fù)蘇36-37
• 3.4.2 823、HT-29細(xì)胞的傳代和培養(yǎng)37
• 3.4.3 k562細(xì)胞的傳代和培養(yǎng)37
• 3.4.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)方法37-38
• 3.4.5 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)38-39
• 3.4.6 體外抑瘤試驗(yàn)39-40
• 3.5 結(jié)果40-41
• 3.5.1 嵌合蛋白刺激鼠PBMC細(xì)胞增殖活性40
• 3.5.2 融合蛋白體外對腫瘤的抑制作用40-41
• 3.6 分析與討論41-43
• 第4章 嵌合蛋白體內(nèi)活性研究43-49
• 4.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>43
• 4.2 方案設(shè)計(jì)與分析43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)材料與試劑43-44
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 4.3.2 實(shí)驗(yàn)試劑43-44
• 4.3.3 儀器與設(shè)備44
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法44-45
• 4.4.1 S_(180)肉瘤小鼠移植瘤模型的構(gòu)建44
• 4.4.2 動(dòng)物分組及給藥44
• 4.4.3 腫瘤、肝臟、脾臟組織的分離和小鼠眼眶取血44-45
• 4.5 結(jié)果45-48
• 4.6 分析與討論48-49
• 第5章 結(jié)論與展望49-51
• 致謝51-52
• 參考文獻(xiàn)52-57
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文以及參加科研情況57

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張東威;金寧一;;HIV-1Gag-gp120嵌合基因在重組桿狀病毒系統(tǒng)中的嵌合表達(dá)[J];中國實(shí)用醫(yī)藥;2009年35期

2 祖東,徐春曉,張智清,譚錦泉;TNF受體(P55)胞外區(qū)和IgGFc嵌合蛋白高效原核表達(dá)載體的構(gòu)建[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年02期

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4 徐春曉,姚立紅,黃國錦,柴映爽,陳愛s，

本文編號(hào)：672580