發(fā)布時間：2017-08-14 06:26

  本文關(guān)鍵詞：MEG3-miR-770-5p-ARPC2通路在上皮性卵巢癌發(fā)病機制中的初步研究

  更多相關(guān)文章： 上皮性卵巢癌 MEG3 宿主基因 遷移 增殖

【摘要】：上皮性卵巢癌(Epithelial ovarian cancer, EOC)發(fā)病隱匿,通常發(fā)現(xiàn)時大部分已是晚期且有轉(zhuǎn)移。眾所周知,異常的細胞增殖和遷移與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān),促進了這一疾病的發(fā)生與進展。長鏈非編碼RNA MEG3(母系表達的基因3)已經(jīng)被報道能通過影響細胞遷移和增殖參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其機制主要是通過P53途徑或DNA甲基化,但目前并而沒有證據(jù)表明可以以宿主基因的功能在腫瘤發(fā)病機理發(fā)揮作用。最近的一項研究報道了MEG3在上皮性卵巢癌中的功能,但沒有研究關(guān)注它的功能在其下游基因的受體。我們研究組通過Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)檢測了上皮性卵巢癌與卵巢良性腫瘤中MEG3的miRNA表達,發(fā)現(xiàn)EOC實驗組較對照組低表達,存在顯著差異。本研究以MEG3為研究出發(fā)點,檢索了pubmed、ensembl等生物信息網(wǎng)站,發(fā)現(xiàn)MEG3基因序列最后面的內(nèi)含子編碼進化上高度保守miR-770-5p,為此探討其MEG3作為宿主基因通過miR-770-5p參與上皮性卵巢癌發(fā)病機制的可能性。我們通過生物信息學軟件預(yù)測miR-770-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)ARPC2是其潛在靶基因。應(yīng)用Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)、Western Blot技術(shù)檢測miR-770-5p及其潛在靶基因ARPC2在上皮性卵巢癌中的表達,發(fā)現(xiàn)miR-770-5p在上皮性卵巢癌中呈現(xiàn)顯著性低表達,而其靶基因ARPC2呈現(xiàn)顯著高表達。同時,我們選用卵巢癌相關(guān)細胞株OMC685與HEY細胞作為體外實驗研究細胞,降低體外細胞中MEG3的表達,發(fā)現(xiàn)細胞的遷移和增殖能力增強。應(yīng)用雙熒光素酶報告基因試驗體外驗證miR-770-5p和其靶基因ARPC2的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)miR-770-5p確實是和ARPC2 3'端未翻譯區(qū)(3' untranslated region,3'UTR)結(jié)合。將miR-770-5p inhibitor (miR-770-5p抑制子)轉(zhuǎn)染到細胞,使miR-770-5p呈低表達水平,然后檢測ARPC2的表達,發(fā)現(xiàn)其呈現(xiàn)高表達水平,且細胞的遷移和增殖能力也同樣增強。通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)抑制體外細胞株中ARPC2的表達,發(fā)現(xiàn)細胞的遷移和增殖能力都得到了部分抑制。通過本研究我們可以得出以下信息：由于宿主基因MEG3的低表達影響了miR-770-5p的表達水平,從而使其靶基因ARPC2呈現(xiàn)高表達,這條信號通路的改變抑制了細胞的遷移和增殖能力,從而在上皮性卵巢癌的發(fā)生中可能發(fā)揮一定的作用。綜上所述,本研究首次探討了MEG3-miR-770-5p-ARPC2通路在上皮性卵巢癌發(fā)病機制中的可能作用,為上皮性卵巢癌的發(fā)生機制研究提供了新的線索和理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：上皮性卵巢癌 MEG3 宿主基因 遷移 增殖
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.31
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 上皮性卵巢癌的背景10-11
• 1.2 非編碼RNA(ncRNA)的研究背景11-12
• 1.3 長鏈非編碼RNA MEG3的研究背景12
• 1.4 研究的目的、意義及內(nèi)容12-14
• 參考文獻14-16
• 第二章 材料與方法16-37
• 2.1 實驗材料16-21
• 2.1.1 組織標本16
• 2.1.2 細胞株16
• 2.1.3 主要試劑16-18
• 2.1.4 主要溶液18-20
• 2.1.5 實驗所用主要儀器20-21
• 2.2 實驗方法21-37
• 2.2.1 RNA提取21-22
• 2.2.2 RNA定量和純度分析22-23
• 2.2.3 逆轉(zhuǎn)錄23-24
• 2.2.4 實時定量PCR24-26
• 2.2.5 蛋白提取26-27
• 2.2.6 蛋白濃度測定與上樣蛋白的制備27-28
• 2.2.7 Western Blot28-31
• 2.2.8 細胞培養(yǎng)31-32
• 2.2.9 質(zhì)粒提取32-33
• 2.2.10 雙熒光素酶報告基因33
• 2.2.11 細胞遷移實驗---Transwell33-34
• 2.2.12 細胞增殖實驗---CCK-834
• 2.2.13 ARPC2 siRNA扭轉(zhuǎn)實驗34-35
• 2.2.14 細胞周期實驗35
• 2.2.15 細胞凋亡實驗35
• 2.2.16 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析35-37
• 第三章 實驗結(jié)果37-49
• 3.1 臨床信息分析37
• 3.2 lncRNA-MEG3及相關(guān)基因的表達37-43
• 3.2.1 MEG3的表達37-38
• 3.2.2 MEG3 mRNA表達與上皮性卵巢癌患者臨床病理特征相關(guān)性38-39
• 3.2.3 內(nèi)含子miR-770-5p的mRNA表達39-40
• 3.2.4 MEG3和miR-770-5p的相關(guān)性分析結(jié)果40
• 3.2.5 miR-770-5p的靶基因預(yù)測及其表達40-42
• 3.2.6 靶基因ARPC2蛋白水平表達42
• 3.2.7 miR-770-5p和ARPC2的相關(guān)性分析結(jié)果42-43
• 3.3 轉(zhuǎn)染MEG3 siRNA后細胞生物學功能的檢測43-45
• 3.4 轉(zhuǎn)染miR-770-5p inhibitor后細胞生物學功能的檢測45-46
• 3.5 體外驗證miR-770-5p與靶基因的調(diào)控關(guān)系46-47
• 3.5.1 雙熒光素酶報告基因驗證調(diào)控關(guān)系46-47
• 3.5.2 體外細胞轉(zhuǎn)染MEG3 siRNA、miR-770-5p inhibitor后ARPC2的表達47
• 3.6 ARPC2 siRNA扭轉(zhuǎn)實驗47-49
• 第四章 討論49-53
• 參考文獻53-55
• 長鏈非編碼RNA在卵巢癌中的研究進展55-65
• 參考文獻61-65
• 縮略語65-66
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況66-67
• 致謝67-68

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