發(fā)布時間：2017-08-13 15:20

  本文關鍵詞：轉錄因子FOXM1不同剪接異構體在乳腺癌EMT過程中的功能研究

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【摘要】：乳腺癌作為威脅女性健康最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在中國上升趨勢明顯。乳腺癌細胞的生長特性是:能無限生長、具有轉化和轉移能力。因此對乳腺癌進行增殖、轉移等作用機制進行深入研究,為腫瘤治療方案及臨床耐藥提供新的靶點。選擇性剪接是指將同一種前體m RNA剪接成多種不同的成熟m RNA剪接變異體,進而產生結構和功能不同的蛋白質的過程。m RNA的選擇性剪接是真核生物產生蛋白質多樣性與基因表達復雜性的主要原因。研究發(fā)現(xiàn),在多種動物組織中,至少90%蛋白編碼基因存在選擇性剪接現(xiàn)象。選擇性剪接導致了蛋白質的多樣性,與多細胞動物細胞增殖、分化和死亡密切相關。研究選擇性剪接的發(fā)生機制、調控以及相應蛋白異構體的功能對于腫瘤的診斷和治療具有重要的意義。上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)是指上皮類型細胞丟失上皮特性如細胞與細胞之間的相互作用等現(xiàn)象,同時獲得了間質表型如細胞移動能力增強。EMT在胚胎的正常發(fā)育和組織器官的分化過程中扮演著重要的角色。EMT對胚胎的著床、原腸胚的形成、傷口愈合、組織再生和器官纖維化等生理和病理過程有重要作用,近年來研究認為EMT是導致惡性腫瘤發(fā)生轉移尤其是腫瘤細胞發(fā)生侵襲行為的重要分子機制。轉錄因子FOXM1是叉頭框(Forkhead box)家族成員,被發(fā)現(xiàn)在多種類型腫瘤中都存在高表達,如乳腺癌、肺癌等。研究證實FOXM1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起到了至關重要的作用,因而它也被認為是預防腫瘤發(fā)生和腫瘤治療的潛在靶基因。目的:探究轉錄因子FOXM1不同的剪接異構體對乳腺癌EMT過程中的影響。方法:采用基因工程方法分別構建了表達FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP兩種FOXM1剪接異構體真核表達質粒,并將其轉染進乳腺癌細胞,采用RT-PCR和Western印跡檢測細胞樣本中FOXM1剪接異構體的表達和EMT相關基因表達,同時采用transwell檢測高表達不同F(xiàn)OXM1剪接異構體細胞的侵襲和遷移能力。結果:成功構建了FOXM1B-EGFP和FOXM1C-EGFP真核表達質粒。外源FOXM1B在乳腺癌間質型細胞的表達高于上皮型細胞,并主要存在于細胞核內,且高表達FOXM1B能夠顯著促進乳腺癌細胞的侵襲和EMT過程。外源FOXM1C在乳腺癌上皮型細胞中的表達高于間質型細胞,并且在細胞核和細胞質中均有表達,高表達FOXM1C能夠顯著抑制細胞的侵襲和EMT過程。結論:乳腺癌細胞中,FOXM1B主要存在于細胞核內,FOXM1C在細胞核和細胞質中均有表達。本研究預示FOXM1B和FOXM1C對乳腺癌細胞EMT過程發(fā)揮不同的影響。
【關鍵詞】：乳腺癌細胞 FOXM1B FOXM1C 遷移 EMT
【學位授予單位】：湖南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 第1章 緒論14-25
• 1.1 乳腺癌概述14-15
• 1.2 上皮間質轉化——EMT過程15-19
• 1.2.1 上皮間質轉化概述15-16
• 1.2.2 上皮間質轉化相關功能16-17
• 1.2.3 上皮間質轉化相關調節(jié)機制17-19
• 1.2.4 上皮間質轉化與表觀遺傳學19
• 1.3 真核生物mRNA的選擇性剪切與連接19-21
• 1.3.1 選擇性剪接的機制和模式19-20
• 1.3.2 選擇性剪接內部外顯子的選擇調控20
• 1.3.3 選擇性剪接與腫瘤20-21
• 1.4 轉錄因子21-23
• 1.4.1 轉錄因子概述21
• 1.4.2 轉錄因子FOXM1概述21-22
• 1.4.3 轉錄因子FOXM1的生物學功能22-23
• 1.4.4 轉錄因子FOXM1與腫瘤23
• 1.5 本論文的工作設想23-25
• 第2章 內源性FOXM1B/C表達與乳腺癌細胞遷移能力25-39
• 2.1 前言25
• 2.2 實驗材料和儀器25-28
• 2.2.1 細胞25
• 2.2.2 其他材料和試劑25-27
• 2.2.3 主要實驗儀器27-28
• 2.3 實驗方法28-36
• 2.3.1 細胞株培養(yǎng)、凍存和復蘇28-29
• 2.3.2 細胞計數(shù)29
• 2.3.3 Transwell實驗29-30
• 2.3.4 總RNA提取、逆轉錄以及RT-PCR30-33
• 2.3.5 Western Blotting（WB）33-36
• 2.3.6 統(tǒng)計分析36
• 2.4 結果與討論36-39
• 2.4.1 研究體系的確定36-38
• 2.4.2 討論38-39
• 第3章 FOXM1B/C-EGFP真核表達質粒的構建與胞內表達39-51
• 3.1 前言39-40
• 3.2 實驗材料和儀器40-42
• 3.2.1 細胞和質粒模板40
• 3.2.2 其他材料和試劑40-41
• 3.2.3 主要實驗儀器41-42
• 3.3 實驗方法42-46
• 3.3.1 FOXM1融合蛋白表達質粒的構建42-45
• 3.3.2 質粒轉染45-46
• 3.3.3 Western Blotting46
• 3.3.4 熒光觀測46
• 3.3.5 統(tǒng)計分析46
• 3.4 結果與討論46-51
• 3.4.1 質粒構建46-47
• 3.4.2 重組質粒在真核細胞MCF-7 和MDA-MB-231細胞內的表達47
• 3.4.3 FOXM1B/C在細胞內的定位47-49
• 3.4.4 討論49-51
• 第4章 高表達FOXM1B促進上皮間質轉化過程51-56
• 4.1 前言51
• 4.2 實驗材料和儀器51-53
• 4.2.1 細胞51
• 4.2.2 其他材料和試劑51-52
• 4.2.3 主要實驗儀器52-53
• 4.3 實驗方法53-54
• 4.3.1 細胞株培養(yǎng)53
• 4.3.2 質粒轉染53
• 4.3.3 總RNA提取、逆轉錄以及RT-PCR53
• 4.3.4 Western Blotting（WB）53
• 4.3.5 Transwell實驗53
• 4.3.6 統(tǒng)計分析53-54
• 4.4 結果與討論54-56
• 4.4.1 MCF-7細胞中高表達FOXM1B各基因的表達情況54
• 4.4.2 MCF-7細胞中高表達FOXM1B遷移能力的變化54-55
• 4.4.3 討論55-56
• 第5章 高表達FOXM1C抑制上皮間質轉化過程56-61
• 5.1 前言56
• 5.2 實驗材料和儀器56-58
• 5.2.1 細胞56
• 5.2.2 其他材料和試劑56-57
• 5.2.3 主要實驗儀器57-58
• 5.3 實驗方法58-59
• 5.3.1 細胞株培養(yǎng)58
• 5.3.2 質粒轉染58
• 5.3.3 總RNA提取、逆轉錄以及RT-PCR58
• 5.3.4 Western Blotting（WB）58
• 5.3.5 Transwell實驗58
• 5.3.6 統(tǒng)計分析58-59
• 5.4 結果與討論59-61
• 5.4.1 MDA-MB-231細胞中高表達FOXM1C各基因的表達情況59
• 5.4.2 MDA-MB細胞中高表達FOXM1C遷移能力的變化59-60
• 5.4.3 討論60-61
• 總結與展望61-63
• 1 結論61
• 2 展望61-63
• 參考文獻63-69
• 附錄A 英文縮寫69-70
• 附錄B 常用緩沖液和試劑配方70-72
• 附錄C 攻讀學位期間發(fā)表的論文72-73
• 致謝73

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