本文關(guān)鍵詞：探究腫瘤相關(guān)基因GIPC2的表達調(diào)控機制

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【摘要】：研究背景：目前在結(jié)直腸癌和惡性黑色素瘤中發(fā)現(xiàn)了GIPC2的外顯子突變,在胃癌中發(fā)現(xiàn)了GIPC2表達上調(diào),相反在腎癌、血癌和腎上腺皮質(zhì)瘤GIPC2表達下調(diào)；31例白血病中發(fā)現(xiàn)29例GIPC2的啟動子區(qū)高甲基化。這些結(jié)果都提示GIPC2可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。研究材料和方法：本研究主要通過構(gòu)建人和大鼠GIPC2翻譯起始位點ATG上游2000bp序列的一系列不同長度截短片段插入至Basic-pGL3多克隆位點的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染到HEK293、HEK293T和PC12等細胞中檢測不同長度截短片段所表現(xiàn)出來的轉(zhuǎn)錄活性。包括利用1)Vista比對不同物種GIPC2基因編碼區(qū)和非編碼區(qū)序列,得到GIPC2同源序列；2)分別構(gòu)建插入人和大鼠GIPC2翻譯起始位點ATG上游不同長度截短片段的重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染人HEK293T細胞和大鼠PC12細胞；3)根據(jù)報告基因熒光強度推斷人和大鼠GIPC2的核心啟動子區(qū)；4)將人GIPC2內(nèi)含子區(qū)同源序列置于核心啟動子前面,構(gòu)建重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HEK293T,HT-29和PC12細胞,檢測轉(zhuǎn)錄活性；5)將人Human-40與Human-30之間保守堿基突變和大鼠Rat-S8與Rat-S11之間最保守堿基單核苷酸突變和次保守堿基突變,構(gòu)建成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T口PC12細胞；6)將大鼠Rat-S8、Rat-S11和Rat-S14轉(zhuǎn)染αt-KG處理HEK293T和PC12細胞,檢測a-KG對GIPC2的調(diào)控作用；7)提取5'aza處理的HEK293T口PC12細胞mRNA, Q-PCR檢測5'aza對GIPC2的調(diào)控作用。8)體外甲基化人和大鼠l3IPC2第一個外顯子,放在核心啟動子前面,構(gòu)建成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細胞,檢測甲基化對GIPC2第一個外顯子的調(diào)控作用。研究結(jié)果：生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)GIPC2在各個物種中非常保守,哺乳動物氨基酸序列和編碼區(qū)序列同源性大于80%；確定了人和大鼠GIPC2核心啟動子為+32至+190序列區(qū)域；人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制GIPC2啟動子活性的功能；人和大鼠GIPC2第一個內(nèi)含子內(nèi)的同源序列有促進啟動子活性的功能；人和大鼠GIPC2第一個外顯子具有促進GIPC2啟動子活性的功能,但是甲基化后促進啟動子活性的功能消失；α-KG可作用于Rat-S8與Rat-S11之間的序列,使得這段序列的抑制啟動子功能消失；5'aza處理HEK293T和PC12細胞后,發(fā)現(xiàn)GIPC2表達量升高100多倍。研究結(jié)論：本研究確定了GIPC2的核心啟動子區(qū)域。在非編碼區(qū)域找到了一系列潛在的順式作用元件能夠調(diào)控GIPC2的表達。發(fā)現(xiàn)GIPC2第一個外顯子具有調(diào)控GIPC2表達的功能。
【關(guān)鍵詞】：GIPC2 基因表達調(diào)控 同源序列 核心啟動子 順式作用元件
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-6
• 一 引言6-18
• 1.1 GIPC2基因6-7
• 1.2 基因表達調(diào)控方式7-15
• 1.2.1 轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控8-12
• 1.2.2 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控12-15
• 1.2.3 表觀水平調(diào)控15
• 1.3 雙熒光報告系統(tǒng)研究基因表達調(diào)控15-18
• 二 材料和方法18-28
• 2.1 實驗材料18-20
• 2.1.1 細胞18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 主要試劑盒18
• 2.1.4 主要耗材,儀器及設(shè)備18-20
• 2.1.5 溶液配制20
• 2.2 實驗方法20-28
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)、傳代、復(fù)蘇及凍存20-21
• 2.2.2 基因組DNA提取,RNA提取21-22
• 2.2.3 快速瓊脂糖凝膠DNA回收22-23
• 2.2.4 質(zhì)粒中量提取23-24
• 2.2.5 RIPA法裂解細胞提取總蛋白和BCA法測定蛋白濃度24
• 2.2.6 Westhern Bolt24-25
• 2.2.7 人和大鼠GIPC2基因翻譯起始位點上游不同長度截短片段重組質(zhì)粒構(gòu)建和人和大鼠外顯子、內(nèi)含子高度同源序列重組質(zhì)粒構(gòu)建25-26
• 2.2.8 細胞轉(zhuǎn)染和雙熒光檢測26
• 2.2.9 Vista及NCBI比對序列同源性和MethPrimer預(yù)測序列CpG island26-27
• 2.2.10 異丙醇/乙酸鈉純化DNA27
• 2.2.11 體外構(gòu)建目標(biāo)序列甲基化重組質(zhì)粒27-28
• 2.2.12 逆轉(zhuǎn)錄及實時定量PCR檢測基因表達28
• 三 實驗結(jié)果28-44
• 3.1 GIPC2的保守性28-29
• 3.2 人和大鼠G/PC2核心啟動子29-31
• 3.3 GIPC2的非編碼區(qū)對GIPC2的調(diào)控作用31-38
• 3.4 α-KG對GIPC2的調(diào)控作用38-40
• 3.5 5'aza對GIPC2的調(diào)控作用40
• 3.6 GIPC2的編碼區(qū)對GIPC2的調(diào)控作用40-44
• 四 討論44-48
• 總結(jié)48-49
• 參考文獻49-56
• 附錄56-59
• 英文名詞及縮寫59-60
• 致謝60-61
• 個人簡歷61-62

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉悅暉;范學(xué)工;丁靜娟;;132例乙型肝炎病毒感染者基本核心啟動子變異分析[J];中國感染控制雜志;2009年04期

2 彭R，

本文編號：664646