本文關(guān)鍵詞：適體共軛的DNA四面體用于乳腺癌細(xì)胞的檢測及阿霉素靶向輸送初步研究

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【摘要】：癌癥是嚴(yán)重影響全人類健康和生命的嚴(yán)重疾病。在癌癥的早期階段對其進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷并且及時(shí)采取有效的治療措施是成功治療癌癥的關(guān)鍵因素。傳統(tǒng)檢測癌癥的方法存在特異性差、靈敏度低、對病人造成傷害等缺點(diǎn),難以滿足腫瘤早期檢測的要求,從而導(dǎo)致癌癥的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移,錯(cuò)過治療的最佳時(shí)機(jī)。近年來,系列針對腫瘤標(biāo)志物的新型分子不斷被開發(fā)出來,為腫瘤早期診斷的臨床應(yīng)用提供了新的機(jī)遇。另一方面,診斷出癌癥后進(jìn)行及時(shí)有效的治療對提高病人的生存率具有十分重要的意義。其中,化療是臨床上最常用的治療方法,但其存在溶解性差、細(xì)胞穿透性差、特異性差、毒副作用大和易產(chǎn)生多藥耐藥性等缺點(diǎn)。因此,構(gòu)建高效的新型藥物載體,以實(shí)現(xiàn)藥物的高效靶向運(yùn)輸,提高藥效,降低藥物毒副作用,逆轉(zhuǎn)腫瘤的多要耐藥性是迫切需要的。適體由于具有高親和力、高特異性、易化學(xué)合成與修飾、靶分子范圍廣泛等諸多優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已在腫瘤研究領(lǐng)域引起了廣泛興趣和關(guān)注。但單純的適體穩(wěn)定性較差,易受復(fù)雜的生理環(huán)境中的酶的降解。研究證明,將適體與納米材料相連能夠達(dá)到保護(hù)核酸適配體抗酶切的目的,同時(shí)也可為適體提供多價(jià)連接的平臺。DNA納米技術(shù)自提出以來,由于其具有結(jié)構(gòu)可編程性、生物相容性好、無明顯的細(xì)胞毒性和免疫刺激性等特點(diǎn),在生物檢測和藥物運(yùn)輸領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注,尤其是在腫瘤的檢測、成像及治療中具有廣泛的應(yīng)用潛力。其中,DNA四面體作為一種尺寸小、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易修飾的納米結(jié)構(gòu),已經(jīng)被廣泛用于藥物輸送及生物傳感器的設(shè)計(jì)中。多篇文獻(xiàn)報(bào)道使用DNA四面體成功輸送免疫刺激劑CpG、抗腫瘤藥物阿霉素、小干擾RNA等進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用,并取得了顯著的效果。因此,DNA四面體被認(rèn)為是一種安全、生物相容性好、穩(wěn)定性高的高效生物載體�；谝陨险撌�,本文構(gòu)建了一種基于適體-DNA四面體的新型腫瘤檢測和靶向藥物運(yùn)輸系統(tǒng),用于對乳腺癌細(xì)胞的靈敏檢測和化療藥物的靶向輸送。本論文共分為三章,對選題背景和意義,研究方法,研究取得的主要成果和結(jié)論進(jìn)行闡述。對研究的應(yīng)用和潛力做出了討論。第一章為緒論部分,首先闡述了癌癥的危害性以及癌癥檢測和治療的重要性；介紹了傳統(tǒng)的癌癥檢測和治療的方法以及其存在的主要缺陷；此外還介紹了DNA納米技術(shù)的發(fā)展以及其在腫瘤的診斷和治療中的應(yīng)用。第二章構(gòu)建了適體-DNA四面體熒光探針用于乳腺癌細(xì)胞MCF-7的靈敏檢測。該探針包括兩個(gè)部分：1)能夠特異性靶向乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)表面MUC 1受體的適體作為識別單元,當(dāng)遇到細(xì)胞膜表面MUC 1受體時(shí),適體構(gòu)象發(fā)生改變,將猝滅鏈置換下來,使得熒光恢復(fù),實(shí)現(xiàn)"trun-on"的信號模式,當(dāng)沒有MUC 1存在時(shí),探針構(gòu)象不發(fā)生變化,熒光保持猝滅狀態(tài)；2)DNA四面體結(jié)構(gòu)作為探針多價(jià)連接的載體,同時(shí)能夠增加探針的穩(wěn)定性。通過在四面體的頂端直接延伸出適體序列將適體探針連接在DNA四面體上,探針通過“一鍋法”反應(yīng)合成,合成方法簡單且產(chǎn)率較高。我們考察了連接不同數(shù)目的適體對檢測MCF-7細(xì)胞的影響,并成功的將該探針用于MCF-7的靈敏檢測中,實(shí)驗(yàn)證明其對MCF-7細(xì)胞具有良好的特異性,并且能夠檢測到最低300個(gè)細(xì)胞。第三章構(gòu)建了細(xì)胞核靶向的適體-DNA四面體(AS 1411-A-Tetra)靶向藥物運(yùn)輸系統(tǒng)。由于傳統(tǒng)藥物載體往往受到溶酶體的分解,將藥物釋放在細(xì)胞質(zhì)而不是細(xì)胞核中,因此降低了藥效,從而產(chǎn)生MDR。為了解決這個(gè)問題,我們在載藥系統(tǒng)中連接能夠靶向細(xì)胞核的適體,將藥物直接運(yùn)輸至細(xì)胞核中,進(jìn)一步避開P-gp介導(dǎo)的藥物外排,以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性。實(shí)驗(yàn)證明AS 1411-A-Tetra載藥系統(tǒng)能夠有效殺傷耐藥細(xì)胞,在逆轉(zhuǎn)多藥耐藥方面有很大的應(yīng)用潛力。
【關(guān)鍵詞】：
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 符號說明14-15
• 第一章 緒論15-31
• 1.1 引言15
• 1.2 腫瘤與癌癥15-20
• 1.2.1 癌癥概述15-16
• 1.2.2 癌癥的診斷16-18
• 1.2.3 癌癥的治療18-20
• 1.3 適體及DNA納米技術(shù)20-31
• 1.3.1 適體20-21
• 1.3.2 DNA納米技術(shù)概述21-24
• 1.3.2.1 簡單分支DNA納米結(jié)構(gòu)22
• 1.3.2.2 基于DNA瓦(DNA tile)的DNA納米結(jié)構(gòu)22
• 1.3.2.3 DNA折紙結(jié)構(gòu)(DNA origami)22-24
• 1.3.3 DNA納米技術(shù)用于癌癥的檢測24-26
• 1.3.4 DNA納米技術(shù)用于癌癥的治療26-30
• 1.3.5 展望30-31
• 第二章 適體共軛的DNA四面體用于乳腺癌細(xì)胞的檢測31-62
• 2.1 引言31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)部分32-39
• 2.2.1 試劑32-33
• 2.2.2 儀器33-34
• 2.2.3 DNA的分裝34
• 2.2.4 高溫高壓滅菌34
• 2.2.5 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存34-35
• 2.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代35
• 2.2.7 細(xì)胞的裂解35-36
• 2.2.8 玻片的處理36
• 2.2.9 適體-DNA四面體探針的合成36-37
• 2.2.10 適體-DNA四面體探針的凝膠電泳表征37
• 2.2.11 適體-DNA四面體探針細(xì)胞毒性的考察37-38
• 2.2.12 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度38
• 2.2.13 共聚焦熒光圖像的獲取38
• 2.2.14 濃度的選擇38
• 2.2.15 時(shí)間的選擇38-39
• 2.2.16 溫度的選擇39
• 2.2.17 特異性結(jié)合39
• 2.2.18 探針靈敏度考察39
• 2.3 結(jié)果與討論39-60
• 2.3.1 適體-DNA四面體熒光探針的建立39-40
• 2.3.2 適體-DNA四面體探針的合成和表征40-41
• 2.3.3 適體-DNA四面體探針細(xì)胞毒性的考察41-42
• 2.3.4 適體-DNA四面體探針穩(wěn)定性考察42-43
• 2.3.5 適體-DNA四面體檢測MCF-7細(xì)胞典型現(xiàn)象考察43-44
• 2.3.6 濃度的選擇44-50
• 2.3.7 反應(yīng)時(shí)間的選擇50-57
• 2.3.8 溫度的選擇57
• 2.3.9 猝滅鏈比例的優(yōu)化57-58
• 2.3.10 特異性結(jié)合58-59
• 2.3.11 探針靈敏度考察59-60
• 2.4 結(jié)論60-62
• 第三章 細(xì)胞核靶向的適體-DNA四面體載藥系統(tǒng)用于逆轉(zhuǎn)MDR62-82
• 3.1 引言62-64
• 3.2 實(shí)驗(yàn)部分64-69
• 3.2.1 試劑64-65
• 3.2.2 儀器65
• 3.2.3 DNA的分裝65-66
• 3.2.4 高溫高壓滅菌66
• 3.2.5 細(xì)胞復(fù)蘇與凍存66
• 3.2.6 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代66
• 3.2.7 玻片的處理66
• 3.2.8 AS 14111-A-Tetra的合成66
• 3.2.9 AS 14111-A-Tetra的凝膠電泳表征66
• 3.2.10 AS 1411-A-Tetra穩(wěn)定性考察66-67
• 3.2.11 AS 1411-A-Tetra中阿霉素的載入67
• 3.2.12 AS1411-A-Tetra載藥系統(tǒng)的細(xì)胞毒性考察67-68
• 3.2.13 細(xì)胞內(nèi)阿霉素的蓄積量考察68
• 3.2.14 AS 1411-A-Tetra與Dox在細(xì)胞內(nèi)分布考察68-69
• 3.3 結(jié)果與討論69-81
• 3.3.1 AS 1411-A-Tetra載藥系統(tǒng)的建立及藥物運(yùn)輸原理69
• 3.3.2. AS 1411-A-Tetra載藥系統(tǒng)的合成與表征69-70
• 3.3.3 AS 1411-A-Tetra穩(wěn)定性考察70-72
• 3.3.4 阿霉素的載入72-74
• 3.3.5 AS1411-A-Tetra細(xì)胞毒性考察74-77
• 3.3.6 細(xì)胞內(nèi)阿霉素蓄積量考察77-80
• 3.3.7 AS 1411-A-Tetra與Dox在細(xì)胞內(nèi)分布考察80-81
• 3.4 結(jié)論81-82
• 參考文獻(xiàn)82-91
• 致謝91-92
• 碩士期間發(fā)表論文92-93
• 附件93

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Overcoming drug efflux-based multidrug resistance in cancer with nanotechnology[J];癌癥;2012年02期

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本文編號：659443