本文關(guān)鍵詞：GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)差異LncRNA篩選及其研究

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【摘要】：甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯(Glycidyl Methacrylate, GMA)是一種縮水甘油醛的衍生物,既含有碳碳雙鍵,又含有環(huán)氧基,可參與離子型和自由基型反應,反應活性高。它作為聚合反應的功能性單體,主要用于化工材料(樹脂、涂料、粘合劑、塑料等)的合成,使相關(guān)產(chǎn)品具有優(yōu)良的防紫外、耐水和耐熱等特性。研究表明,GMA屬低毒類,多項致突變實驗(如Ames試驗、體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗、哺乳動物微核試驗)結(jié)果呈陽性,具有遺傳毒性；GMA可誘導BALB/c3T3細胞、原代培養(yǎng)金倉鼠胚胎細胞、人胚肺細胞和16HBE人支氣管上皮細胞等多種哺乳動物細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,具有潛在致癌性。長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)是一類長度大于200bp不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子總稱,可以在表觀遺傳修飾水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后加工以及翻譯水平等多個層面上參與調(diào)控基因的表達。目前,LncRNA作用靶點及作用機制尚不清楚,但LncRNA參與的基因表達調(diào)控網(wǎng)絡既重要而又非常復雜。研究證實LncRNA與人類的腫瘤密切相關(guān),LncRNA差異表達于正常組織與腫瘤組織間,多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中伴隨LncRNA異常表達,不同腫瘤某些特定LncRNA表達水平會發(fā)生改變。因此,特異性LncRNA可作為腫瘤的預測因子,其可作為腫瘤早期發(fā)現(xiàn)和診斷相關(guān)生物標志物。惡性腫瘤是由細胞惡性轉(zhuǎn)化發(fā)展而來的,是細胞惡變增殖的結(jié)果,細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化過程中也伴隨LncRNA異常表達,提示識別細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)特異LncRNA不僅有利于揭示環(huán)境化學物致細胞癌變的分子機制,也可將其作為環(huán)境化學物致細胞癌變的潛在分子標志。本研究在已完成的GMA致16HBE (human bronchial epithelial,人支氣管上皮)細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中相關(guān)差異表達基因譜、甲基化基因及沉默基因篩選研究工作基礎(chǔ)上,以8μg/mL GMA反復接觸16HBE細胞,染毒3次,每次染毒72h,兩次染毒間隔24h;以溶劑DMSO處理的同步培養(yǎng)的細胞為對照。染毒結(jié)束記為第0代,細胞長滿后傳代培養(yǎng)至30代,DMSO組同步進行。期間觀察細胞形態(tài)學變化,并采用刀豆凝集素A (ConA)凝集試驗和錨著非依賴性(AIG)試驗進行細胞生物學特性鑒定。收集GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞(第30代)及同代齡DMSO溶劑對照組細胞,采用最新高通量Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片,通過比較GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞與同代齡DMSO對照組細胞LncRNA表達差異,篩選GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)差異表達LncRNA以及差異表達LncRNA相關(guān)mRNA;對差異表達LncRNA相關(guān)mRNA進行GO和Pathway分析,初步探討GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中差異表達LncRNA的功能,為探究LncRNA在GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中的作用機制提供可靠實驗數(shù)據(jù)；通過LncRNA差異倍數(shù)及其相關(guān)鄰近編碼基因信息分析等策略篩選出目標LncRNA,經(jīng)實時熒光定量PCR (qPCR)驗證、分析,確定GMA誘導的惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)特定LncRNA;對特定LncRNA進行生物信息學分析,利用基于生物信息學建立的以預測LncRNA功能及其靶基因為目的的數(shù)據(jù)庫,進一步篩選出特定LncRNA相關(guān)mRNA,結(jié)合已完成的差異表達基因譜的研究結(jié)果進一步探討特定LncRNA在GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中表達及對其蛋白編碼基因調(diào)控作用。1 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)差異LncRNA篩選GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中,與同代齡DMSO對照組細胞相比,共篩選出2664個差異表達的LncRNA,其中上調(diào)896個,上調(diào)倍數(shù)為2.0～198.8；下調(diào)1768個,下調(diào)倍數(shù)為2.0～262.1。同時檢測發(fā)現(xiàn)2216個差異表達LncRNA相關(guān)的mRNA,其中上調(diào)706個,上調(diào)倍數(shù)為2.0～642.0；下調(diào)1510個,下調(diào)倍數(shù)為2.0～74.9。2 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞差異表達LncRNA分析差異表達LncRNA相關(guān)mRNA的GO分析顯示,差異表達LncRNA相關(guān)mRNA參與的分子功能注釋的條目有166項,主要參與分子粘合物、蛋白結(jié)合物、核苷酸結(jié)合物、激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性及受體結(jié)合物等功能；差異表達LncRNA相關(guān)mRNA參與的生物學過程注釋的條目有869項,主要參與細胞周期、新陳代謝、細胞代謝及有機物代謝等功能;差異表達LncRNA相關(guān)mRNA參與的細胞組成注釋的條目有20項,主要參與調(diào)控細胞、細胞核、細胞膜、膜元件、細胞質(zhì)和細胞器等。差異表達LncRNA相關(guān)mRNA的Pathway分析顯示,在GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中有25條和17條分別受上調(diào)和下調(diào)mRNA調(diào)控,其中,上調(diào)mRNA主要參與調(diào)控與錯位修復、DNA復制、震顫性麻痹等功能相關(guān)的通路,下調(diào)mRNA主要參與調(diào)控與蛋白的消化吸收、刺激神經(jīng)組織的受體和配體相互作用、細胞黏附分子等功能相關(guān)的通路。3目標LncRNA的驗證及其功能探討GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中,與同代齡DMSO對照組細胞相比,LncRNA芯片結(jié)果顯示,PCA3、CTBP1-AS1和CDKN2B-AS1表達分別上調(diào)7.17、2.20和5.39倍,經(jīng)qPCR確證,PCA3、CTBP1-AS1表達量與芯片結(jié)果一致,提不PCA3、CTBP1-AS1可作為GMA致16HBE細胞惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)特定LncRNA;根據(jù)生物學信息預測及相關(guān)文獻報道分析,確定PCA3和CTBP1-AS1最可能的相關(guān)蛋白編碼基因分別為PRUNE2和CTBP1,LncRNA芯片顯示,PRUNE2下調(diào)2.54,CTBP1上調(diào)1.26倍,差異表達基因譜結(jié)果與LncRNA芯片所獲結(jié)果一致,提示LncRNA PCA3、CTBP1-AS1可能是通過調(diào)控其蛋白編碼基因的表達而起作用,推測LncRNA PCA3、CTBP1-AS1可能是GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)特異分子標志。綜上所述,以8μg/mL GMA反復接觸16HBE細胞,可誘導16HBE細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化細胞具備惡性生物學特性；與同步培養(yǎng)的DMSO對照細胞相比,GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中存在多個異常表達LncRNA及其相關(guān)mRNA;對差異表達LncRNA相關(guān)mRNA進行GO和Pathway分析提示,差異表達mRNA參與了多項GO條目及通路的調(diào)控,為深入探討LncRNA在GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中的作用機制提供可靠實驗數(shù)據(jù)；LncRNA芯片、qPCR法及前期差異表達基因譜結(jié)果提示,特定LncRNA PCA3、CTBP1-AS 1可能是通過調(diào)控其蛋白編碼基因的表達而起作用,推測LncRNA PCA3、CTBP 1-AS 1可能是GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)特異分子標志。
【關(guān)鍵詞】：甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯 人支氣管上皮細胞 LncRNA芯片 PCA3 CTBP1-AS1 全基因組表達譜芯片
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 英文縮略詞表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)差異LncRNA的篩選17-56
• 引言17-55
• 1 實驗材料18-20
• 1.1 細胞轉(zhuǎn)化試驗18-19
• 1.2 LncRNA芯片篩選19-20
• 2 試驗方法20-30
• 2.1 GMA誘導人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化20-22
• 2.2 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)差異LncRNA的篩選22-29
• 2.3 質(zhì)量控制29-30
• 3 結(jié)果30-52
• 3.1 GMA誘導的人支氣管上皮細胞惡性轉(zhuǎn)化結(jié)果30-32
• 3.2 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞相關(guān)差異LncRNA篩選結(jié)果32-52
• 4 討論52-55
• 小結(jié)55-56
• 第二部分 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞差異表達LncRNA的分析56-64
• 引言56-63
• 1 試驗材料56
• 2 試驗方法56-57
• 2.1 GO分析56-57
• 2.2 Pathway分析57
• 3 結(jié)果57-62
• 3.1 差異表達mRNA的GO分析57-60
• 3.2 差異表達mRNA的Pathway分析60-62
• 4 討論62-63
• 小結(jié)63-64
• 第三部分 GMA誘導的16HBE惡性轉(zhuǎn)化細胞中目標LncRNA的驗證及其功能探討64-73
• 引言64-73
• 1 試驗材料64
• 2 試驗方法64-66
• 2.1 RNA提取和質(zhì)量檢測64
• 2.2 制備用于繪制標準曲線的梯度稀釋DNA模板64-65
• 2.3 進行Realtime PCR反應65-66
• 3 統(tǒng)計學分析方法66
• 4 結(jié)果66-70
• 4.1 LncRNA芯片結(jié)果66
• 4.2 質(zhì)量檢測結(jié)果66-67
• 4.3 PCA3、CTBP1-AS1、CDKN2B-AS1 qPCR的熔解曲線和擴增曲線67-69
• 4.4 PCA3、CTBP1-AS1、CDKN2B-AS1 qPCR法表達量結(jié)果69-70
• 4.5 PCA3、CTBP1-AS1最可能的mRNA的LncRNA芯片和表達譜芯片結(jié)果70
• 5 討論70-73
• 小結(jié)73
• 總結(jié)73-76
• 參考文獻76-81
• 致謝81-82
• 論著82-98
• 個人簡歷98

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本文編號：655492