本文關(guān)鍵詞：缺氧在食管鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及干細(xì)胞化中的作用

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【摘要】：研究背景我國是世界上食管癌的高發(fā)國家之一。盡管食管癌患者可以采取手術(shù),放化療等綜合治療方法,但患者5年存活率仍僅為30%左右。食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是患者生存率下降的主要原因,因此也成為了該領(lǐng)域研究的熱點。在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中,上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)發(fā)揮著尤為重要的作用。上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞是多細(xì)胞生物胚胎發(fā)育的關(guān)鍵步驟,并且對器官發(fā)育的結(jié)構(gòu)特征具有決定性作用,而現(xiàn)在對其更多的研究主要集中于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面。Elizabeth在溫哥華舉行的EMT會議上首次對其做了詳盡的描述,并闡明了EMT機制在胚胎發(fā)育和腫瘤形成過程中的主要區(qū)別。腫瘤在侵襲和轉(zhuǎn)移的過程中,腫瘤上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后,E-鈣粘蛋白(E-cadherin)、細(xì)胞角蛋白(Cytokeratin)等上皮標(biāo)志物表達(dá)降低,同時波形蛋白(Vimentin)、α肌動蛋白(α-smooth muscle actin,SMA)等間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)增加,致使上皮細(xì)胞極性喪失,細(xì)胞間粘附力下降,侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強,有利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫落形成局部浸潤,并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處部位。腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells,CSCs)是腫瘤組織中存在的極少數(shù)具有自我更新能力和分化潛能的腫瘤細(xì)胞。截止目前,已經(jīng)在多種實體瘤中成功分選出了CSCs,并證實:這些細(xì)胞具備高致瘤能力,能夠驅(qū)動腫瘤的形成,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移,并且對放化療具有高度耐受性。因此,研究學(xué)者廣泛認(rèn)為CSCs可能在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用,并有可能成為治愈癌癥的靶點。p75NTR又稱低親和力p75神經(jīng)營養(yǎng)素受體,已經(jīng)證實:從食管正常組織和食管癌細(xì)胞系中分選的p75NTR+細(xì)胞具有顯著的干細(xì)胞特性。目前,研究人員也已經(jīng)將p75NTR作為分選正常食管上皮干細(xì)胞/祖細(xì)胞的標(biāo)記物。缺氧是實體瘤中普遍存在的現(xiàn)象。以往觀點認(rèn)為:腫瘤細(xì)胞本身的特性是導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移主要原因,而忽視了腫瘤微環(huán)境在其中發(fā)揮的重要作用。如今,研究表明:腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境相互作用的最終結(jié)果。缺氧誘導(dǎo)因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)是由HIF-1α和HIF-β組成的異源二聚體,是調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子。低氧條件下,HIF-1a與位于細(xì)胞核內(nèi)的HIF-β結(jié)合形成異二聚體,進(jìn)而與靶基因啟動子或增強子上的低氧反應(yīng)元件(hypoxic response elements,HREs)進(jìn)行結(jié)合,啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄活性。研究表明:缺氧和缺氧信號通路能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的幸存、侵襲和轉(zhuǎn)移能力;腫瘤的血管生成以及對放化療藥物的耐受性進(jìn)行調(diào)控,促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。最近研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中,上皮腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變后,不僅其遷移和侵襲能力增加,同時還涉及代謝、表觀遺傳學(xué)以及分化等一系列復(fù)雜過程。分化的上皮腫瘤細(xì)胞可以通過EMT轉(zhuǎn)化為未分化狀態(tài),不僅可以表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志,而且可以獲得干細(xì)胞樣特征。更重要的是,缺氧以及缺氧信號通路在調(diào)控CSCs和EMT中都起到至關(guān)重要的作用,影響腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后。因此,探究缺氧微環(huán)境及缺氧信號通路對腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的影響是一項重要的研究課題。本實驗擬探討缺氧對食管鱗癌干細(xì)胞化的影響及在食管鱗癌EMT中的作用,進(jìn)一步闡明食管鱗癌發(fā)生EMT的機制,探討影響食管鱗癌EMT的可能因素。第一部分食管鱗癌細(xì)胞缺氧模型的建立及對HIF-1α表達(dá)的影響研究方法使用終濃度為150μmol/L Co Cl2的培養(yǎng)液培養(yǎng)食管鱗癌細(xì)胞株Eca-109用于模擬缺氧環(huán)境,并對Eca-109細(xì)胞進(jìn)行不同時間(4h、8h、12h、24h、36h)的缺氧培養(yǎng),并以常氧培養(yǎng)作為對照(常氧組)。1.形態(tài)學(xué)觀察:于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的生長狀態(tài)及細(xì)胞形態(tài)的變化,篩選出Co Cl2作用的最佳時間。2.Western blotting法:檢測食管鱗癌細(xì)胞Eca-109在缺氧4h、8h、12h、24h和36h不同培養(yǎng)條件下HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。3.Real-time PCR法:檢測食管鱗癌細(xì)胞Eca-109在缺氧4h、8h、12h、24h和36h不同培養(yǎng)條件下HIF-1αm RNA的表達(dá)情況。結(jié)果1.形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn):與常氧組相比較,缺氧各組中細(xì)胞之間的連接松散,隨著缺氧時間的延長,梭形細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,此外,漂浮死亡的細(xì)胞也逐漸增多。缺氧24h組的細(xì)胞死亡量較缺氧12h組稍多,但不如缺氧36h組明顯,為避免Co Cl2對細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性作用,因此使用終濃度為150μmol/L Co Cl2、作用食管鱗癌細(xì)胞Eca-109 24h作為后續(xù)部分實驗的缺氧組。2.Western blotting結(jié)果顯示:HIF-1α蛋白的表達(dá)量在常氧組中為0.550±0.011,而進(jìn)行不同時間的缺氧培養(yǎng)后,缺氧4h(0.941±0.020)、8h(1.070±0.018)、12h(1.079±0.032)、24h(1.103±0.025)和36h(0.984±0.014)組中HIF-1α蛋白的表達(dá)量均增加。缺氧各組與常氧組相比,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.Real-time PCR結(jié)果顯示:HIF-1αm RNA的表達(dá)量在常氧組中為1±0.066,與常氧組相比,缺氧4h組(0.631±0.113)和缺氧8h組(0.612±0.150)的HIF-1αm RNA表達(dá)量明顯降低,而缺氧12h(2.612±0.250)、24h(3.948±0.930)和36h(3.052±1.350)組中的表達(dá)量明顯增加,分別是常氧組的2.612倍、3.948倍和3.052倍。缺氧12h、24h、36h組與常氧組相比,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第二部分缺氧促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤干細(xì)胞化研究方法1.Western blotting法:檢測常氧組和缺氧組Eca-109細(xì)胞中Hi F-1α、E-cadherin、Vimentin、Oct-4、Nanog的蛋白表達(dá)情況。2.免疫熒光法:檢測常氧組和缺氧組Eca-109細(xì)胞中Nanog蛋白的表達(dá)情況。3.Real-time PCR法:檢測常氧組和缺氧組Eca-109細(xì)胞中Hi F-1α、E-cadherin、Vimentin、Oct-4、Nanog的m RNA表達(dá)情況。4.Transwell侵襲小室:檢測常氧組和缺氧組中Eca-109細(xì)胞的體外侵襲能力。5.流式細(xì)胞術(shù):檢測常氧組、缺氧組和同型對照組Eca-109細(xì)胞中p75NTR+細(xì)胞的比例。結(jié)果1.Western blotting結(jié)果顯示:食管鱗癌細(xì)胞Eca-109在常氧組中HIF-1α(0.437±0.022),E-cadherin(0.637±0.087)、Vimentin(0.823±0.037)、Oct-4(0.876±0.003)、Nanog(0.582±0.004)蛋白均有表達(dá);在缺氧組中,HIF-1α(0.970±0.060)、Vimentin(1.240±0.020)、Oct-4(1.156±0.034)和Nanog(1.163±0.042)蛋白的表達(dá)均增加,而E-cadherin(0.168±0.048)蛋白的表達(dá)降低。缺氧組與常氧組相比,其差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.免疫熒光結(jié)果顯示:與常氧組相比,在缺氧組Eca-109細(xì)胞中Nanog蛋白的表達(dá)量明顯增加。3.Real-time PCR結(jié)果顯示:HIF-α、Vimentin、Oct-4、Nanog的m RNA表達(dá)在常氧組中分別為1±0.228,1±0.214,1±0.249,1±0.333,與常氧組相比,缺氧組中HIF-1α(2.500±0.150)、Vimentin(2.185±0.070)、Oct-4(2.674±0.364)、Nanog(3.305±0.327)的m RNA表達(dá)量明顯增高,分別是常氧組的2.5、2.185、2.674和3.305倍,E-cadherin的m RNA表達(dá)量在常氧組中為1±0.345,而在缺氧組中明顯下降為0.123±0.058。缺氧組與常氧組相比,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果顯示:在常氧組和缺氧組中,p75NTR+細(xì)胞的比例分別為2.00±0.327%和2.74±0.137%,缺氧組與常氧組相比,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。由此可見,正常情況下食管鱗癌細(xì)胞Eca-109中存在少量p75NTR+細(xì)胞,而缺氧能夠增加Eca-109細(xì)胞中p75NTR+細(xì)胞的比例。5.Transwell體外侵襲實驗結(jié)果顯示:常氧組和缺氧組食管鱗癌細(xì)胞Eca-109的穿膜數(shù)分別為51±11.769、118±17.875,缺氧能夠明顯增強食管鱗癌細(xì)胞Eca-109的體外侵襲能力,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。全文結(jié)論1.缺氧能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,2.缺氧能夠增強食管鱗癌細(xì)胞的體外侵襲力。2.缺氧能夠誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞的干細(xì)胞化。
【關(guān)鍵詞】：食管鱗癌 HIF-1α 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 腫瘤干細(xì)胞 p75NTR 侵襲
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.1
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 縮略語/符號說明16-17
• 前言17-20
• 第一部分:食管鱗癌細(xì)胞缺氧模型的建立及對HIF- 1a表達(dá)的影響20-36
• 材料20-23
• 實驗方法23-30
• 統(tǒng)計分析30
• 實驗結(jié)果30-34
• 討論34-36
• 第二部分:缺氧促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化及腫瘤干細(xì)胞化36-48
• 材料36-37
• 實驗方法37-40
• 統(tǒng)計分析40
• 實驗結(jié)果40-45
• 討論45-48
• 全文結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述53-66
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 個人簡歷66
• 教育經(jīng)歷66-67
• 致謝67

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本文編號：650241