本文關(guān)鍵詞：VPA促進(jìn)冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： VPA 冬凌草甲素 凋亡 白血病 HL-60細(xì)胞 MAPK caspase

【摘要】：背景冬凌草甲素(oridonin,ORI)是從傳統(tǒng)中藥冬凌草中提取出來(lái)的四環(huán)二萜類(lèi)天然有機(jī)化合物,是冬凌草中發(fā)揮作用的主要成分,具有抗炎、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能,近年來(lái),研究表明冬凌草甲素能抑制乳腺癌、宮頸癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng),也能抑制急性白血病的惡化,是一種理想的治療急性白血病的藥物。組蛋白去乙�；敢种苿�(HDACi)能抑制組蛋白脫乙酰酶,增加組蛋白過(guò)乙�；瘜�(dǎo)致染色體重組、細(xì)胞周期停滯、誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡等一系列生物學(xué)作用。研究表明,VPA作為一種組蛋白去乙�；敢种苿�,單獨(dú)或者與其他藥物聯(lián)合作用可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗白血病的作用。為了增強(qiáng)中藥ORI療效同時(shí)降低化療藥物VPA副作用,本研究將小劑量ORI和VPA進(jìn)行聯(lián)合用藥,觀察他們對(duì)急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞增殖和凋亡的影響并探討其作用機(jī)制,為臨床治療急性早幼粒白血病提供新方案打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目的探討VPA與冬凌草甲素(oridonin,ORI)聯(lián)合誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制。方法CCK-8法選取ORI和VPA最佳協(xié)同作用劑量;VPA和ORI單獨(dú)或聯(lián)合作用于HL-60細(xì)胞后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化以及Hoechst33342染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化;AnnexinV/PI試劑盒檢測(cè)HL-60細(xì)胞凋亡率;RT-PCR檢測(cè)Bax/Bcl-2等凋亡相關(guān)基因mRNA水平改變;并通過(guò)RT-PCR篩選參與外源性信號(hào)通路的死亡受體配體對(duì);Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase-8、caspase-9的蛋白表達(dá)和caspase-3剪切片段的表達(dá);預(yù)先加入或不加入caspase抑制劑處理HL-60細(xì)胞,采用Annexin V/PI流式試劑盒檢測(cè)兩藥聯(lián)合后細(xì)胞凋亡的變化;Western blot檢測(cè)ERK、Pi-ERK,P38、Pi-P38,JNK、Pi-JNK的蛋白表達(dá);分別加入MAPK抑制劑后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,并通過(guò)WB檢測(cè)caspase-3的蛋白表達(dá);建立APL動(dòng)物模型驗(yàn)證ORI+VPA能否誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。結(jié)果冬凌草甲素與VPA聯(lián)合治療抑制HL-60細(xì)胞增殖;VPA增強(qiáng)冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡;光學(xué)顯微鏡下和Hoechst33342染色后熒光顯微鏡下觀察:ORI+VPA組比單獨(dú)用藥組細(xì)胞凋亡率多;冬凌草甲素和VPA聯(lián)合作用激活caspase-3、caspase-8和caspase-9;內(nèi)源性凋亡途徑中Bax蛋白表達(dá)增高,而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)降低;外源性凋亡途徑中死亡受體配體對(duì)Fas/fasl表達(dá)增高;MAPK信號(hào)通路中ERK和P38發(fā)生磷酸化,而JNK未發(fā)生磷酸化;APL動(dòng)物模型中ORI+VPA組實(shí)體瘤體積最小,TUNEL結(jié)果顯示ORI和VPA能誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。結(jié)論VPA確實(shí)能促進(jìn)ORI誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡,兩者具有協(xié)同作用;VPA+ORI誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡具有caspase依賴性;凋亡通過(guò)內(nèi)源性和外源性兩條途徑,且死亡受體DR4/DR5和Fas/Fasl均參與介導(dǎo)外源性凋亡途徑;ERK和P38兩條非特異性信號(hào)通路參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;而JNK信號(hào)通路基本沒(méi)有參與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡;建立APL動(dòng)物模型,由體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果,兩者相符。
【關(guān)鍵詞】：VPA 冬凌草甲素 凋亡 白血病 HL-60細(xì)胞 MAPK caspase
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R733.71
【目錄】：

• 研究生導(dǎo)師及課題小組成員簡(jiǎn)介5-8
• 摘要8-10
• Abstract10-13
• 主要符號(hào)表13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-27
• 1.1 主要材料和儀器16-18
• 1.2 HL-60白血病細(xì)胞的傳代與培養(yǎng)18
• 1.3 CCK-8 檢測(cè)兩藥聯(lián)合作用18-19
• 1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察19
• 1.5 Annexin V/PI流式試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡19-20
• 1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分析20-24
• 1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)分析24-26
• 1.8 白血病小鼠動(dòng)物模型的建立26
• 1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法26-27
• 結(jié)果27-44
• 2.1 冬凌草甲素與VPA聯(lián)合治療抑制HL-60細(xì)胞增殖27-29
• 2.2 VPA增強(qiáng)冬凌草甲素誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡29-32
• 2.3 冬凌草甲素和VPA聯(lián)合作用激活caspase-3、caspase-8 和caspase-932-34
• 2.4 內(nèi)源性凋亡通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)34-36
• 2.5 外源性凋亡通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)36-37
• 2.6 MAPK信號(hào)通路與ORI和VPA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的關(guān)系37-41
• 2.7 APL動(dòng)物模型驗(yàn)證冬凌草甲素和VPA聯(lián)合作用機(jī)制41-43
• 2.8 凋亡信號(hào)通路相關(guān)模式圖43-44
• 討論44-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 綜述53-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 攻讀碩士學(xué)位期間的研究成果61-62
• 致謝62

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