發(fā)布時(shí)間：2017-08-08 20:14

  本文關(guān)鍵詞：miR-135b在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制的初步探討

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【摘要】：研究背景子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma, EC)在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中占20%-30%,在發(fā)達(dá)國家的女性惡性腫瘤中位居第四位。在發(fā)展中國家,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率也位居于女性腫瘤的第7位。子宮內(nèi)膜癌常發(fā)于絕經(jīng)后婦女,但近年臨床研究顯示,子宮內(nèi)膜癌有明顯的年輕化趨勢。雖然早期子宮內(nèi)膜癌經(jīng)過規(guī)范治療后,5年的生存率逐年升高,但晚期、低分化子宮內(nèi)膜癌或者特殊類型的子宮內(nèi)膜癌預(yù)后極差,是導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌患者死亡的重要因素。因此,子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)理和有效治療靶點(diǎn)成為改善子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的首要課題。目前大多數(shù)研究表明子宮內(nèi)膜癌與長期暴露于無抵抗的雌激素相關(guān),或者與肥胖、高血壓、糖尿病相關(guān),但子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的機(jī)制尚不明確,基因調(diào)控異常如基因表達(dá)多態(tài)性等不足以完全解釋子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和發(fā)展。近年來的研究表明mircroRNA與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系,參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)程的分子機(jī)制和雌孕激素的表達(dá)。miRNA是近些年來研究的熱點(diǎn),是一類廣泛存在的非編碼單鏈小分子RNA,是Lee等最早在秀麗線蟲中發(fā)現(xiàn)的,長度約為19-25個(gè)核苷酸。Lee研究團(tuán)隊(duì)最早提出了miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)�，F(xiàn)在人類中miRNA已發(fā)現(xiàn)超過1000多個(gè),調(diào)控著約30%的人類基因。隨后研究在很多惡性腫瘤例如直腸癌、前列腺癌、骨肉瘤中發(fā)現(xiàn)miRNA發(fā)揮著促癌或抑癌作用。micro RNA通過堿基互補(bǔ)配對的方式與靶基因的3'UTR區(qū)域結(jié)合,降解靶基因mRNA或阻遏靶基因mRNA的翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá),從而影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移。同樣,microRNAs在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展的過程中扮演著促癌或抑癌的雙重角色,參與到子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和進(jìn)展的各個(gè)時(shí)期,通過與對應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)靶基因的3'UTR區(qū)域結(jié)合,負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)。此外miRNA與腫瘤細(xì)胞的化療敏感性密切相關(guān),很在可能成為一個(gè)判斷子宮內(nèi)膜癌順鉑治療預(yù)后的標(biāo)志。miR-135b基因位于第1號染色體長臂第3區(qū)2號帶的第1號亞帶(1q32.1),其存骨肉瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中表達(dá)上升。在非小細(xì)胞肺癌中,miR-135b通過激活Hippo信號通路和靶向LZTS1促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。Arigoni等發(fā)現(xiàn)mi R-135b表達(dá)上調(diào)并通過靶向雌激素受體α、雄激素受體和缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1a)促進(jìn)乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞的增殖。miR-135b在人頭頸鱗癌細(xì)胞中,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、克隆,以及通過下調(diào)FIH的表達(dá)、HIF通路的活性,成為致瘤miRNA 。 Valeri等的研究顯示,miR-135b的過度表達(dá)觸發(fā)了老鼠和人體APC的缺失,PTEN/PI3K通路的反常,SRC的過度表達(dá)及促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)化和進(jìn)展,]miR-135b的上調(diào)在與人類結(jié)直腸癌相關(guān)的炎癥中是普遍事件,并且與腫瘤分期及欠佳的臨床結(jié)果有密切關(guān)系。糞便中的miR-135b,可作為結(jié)直腸癌及高級別腺瘤的非侵襲性的生物學(xué)標(biāo)記物。然而miR-135b在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、與臨床的相關(guān)性及其生物學(xué)特性,還未有報(bào)道�；趍iR-135b的研究現(xiàn)狀,本課題通過探討miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織及4株細(xì)胞中表達(dá)情況,運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明miR-135b的生物學(xué)特性,并進(jìn)一步探討了miR-135b在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用和分子機(jī)制,為進(jìn)一步尋找新的子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機(jī)制和治療的靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。方法1 RT-PCR檢測miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)從子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中抽提總RNA,按寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒說明書,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,根據(jù)SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR,以2-△△Ct表示基因的相對表達(dá)水平。2 RT-PCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染niRNA135b的轉(zhuǎn)染效率采用陽離子脂質(zhì)體法,按照LipofectamineTM 3000試劑說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天將處于對數(shù)生長期的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa消化、離心、計(jì)數(shù),約為2×105/孔接種至6孔板中并繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞融合度為30-50%時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。棄上清,加入1.7m1含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；將購自于RiboBio公司的100nM siRNA加入到無血清培養(yǎng)基中配制混合液①1500,1,吹打混勻；將5μl LipofectamineTM 3000脂質(zhì)體加入到另一無血清培養(yǎng)基中配制混合液②1500μ1,吹打混勻,室溫孵育5min；將混合液②分別加入混合液①中,室溫孵育20min,以形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物,并最終加入到1.7ml含10%胎牛血清的DMEM局糖培養(yǎng)基中,輕搖混勻。其中,mimic NC和inhibitor NC作為內(nèi)參。48h后抽提細(xì)胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, qRT-PCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后miR-135b的表達(dá)變化。3噻唑藍(lán)(MTT)比色實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中,12h細(xì)胞貼壁后轉(zhuǎn)染細(xì)胞,分為mimic、mimic NC、inhibitor、inhibitor NC和空白組,6孔/組,分別于轉(zhuǎn)染后Oh、24h、48h、72h、96h檢測一次。檢測前每孔中加入5mg/ml的MTT溶液200μl,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄上清,加入DMSO溶液150μl,搖床上室溫輕搖10min充分溶解結(jié)晶物,以空白孔調(diào)零,酶標(biāo)儀上測定490nm波長處的吸光度值,用來表示細(xì)胞增殖能力。各組取6孔平均值,繪制生長曲線。4細(xì)胞劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞RL-952接種在六孔板中,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h細(xì)胞融合度為90%時(shí),用2000μ1加樣槍頭,沿直尺垂直培養(yǎng)孔并經(jīng)過其中點(diǎn)制造“十”字樣劃痕。棄上清,PBS緩沖液洗2-3次,以去除脫落細(xì)胞,更換為無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。選取有劃痕穿過的視野于0,24h,48h進(jìn)行拍照,計(jì)算并比較各組的遷移率。5 RT-PCR檢測FOXO1和HOXA10在子宮內(nèi)膜癌組織與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)從子宮內(nèi)膜癌組織和細(xì)胞中抽提總RNA,按寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒說明書,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA,根據(jù)SYBR Green法進(jìn)行熒光定量PCR,以2-△△Ct表示基因的相對表達(dá)水平。6 RT-PCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA135b后FOXO1的mRNA的變化子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa轉(zhuǎn)染48h后提取細(xì)胞總RNA,按寶生物公司逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR試劑盒操作,采用△△CT法對熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行定量分析,根據(jù)各樣本的Ct值,以2-△△Ct表示基因的相對表達(dá)水平。7 Western blot檢測在FOXO1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)變化RL-952細(xì)胞株轉(zhuǎn)染48h后,提取全蛋白,根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量,測定A562。計(jì)算各濃度蛋白標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。提取的總蛋白,加入2×SDS蛋白上樣緩沖液(按1：1比例),100℃煮沸5min.-20℃保存?zhèn)溆�。Western blot檢測各組FOXO1蛋白的表達(dá)。8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)值大小以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。22例子宮內(nèi)膜癌組織及相應(yīng)的癌旁組織中表達(dá)的比較采用兩配對樣本t檢驗(yàn),其余實(shí)驗(yàn)組間比較采用ANOVA單因素方差分析,MTT生長曲線比較采用析因設(shè)計(jì)的方差分析。所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1 RT-PCR檢測miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織內(nèi)表達(dá)應(yīng)用RT-PCR檢測22對配對的子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135b的表達(dá),以1NC為參考值,2-ΔΔCt通過配對樣本t檢驗(yàn)分析,結(jié)果示子宮內(nèi)膜癌組織中miR-135b的平均表達(dá)量為8.3559±10.6692,顯著大于子宮內(nèi)膜癌癌旁組織中niR-135b的平均表達(dá)量為4.1930±5.1132,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.247.P=0.036)。2 RT-PCR檢測miR-135b、FOXO1在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以JEC細(xì)胞為參照(圖1),miR-135b在不同細(xì)胞中的表達(dá)量分別為Ishikawa (111.5150±11.7878)、HEC-1-B (20.8096±5.7010)、RL-952 (1.6737±0.3428)4株細(xì)胞之間miR-135b的表達(dá)水平有差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=129.3,P0.0001) 。FOXO1在不同細(xì)胞中的表達(dá)量分別為Ishikawa (0.0640 ± 0.0150), HEC-1-B (0.2994±0.0592)、 RL-952 (0.4548 ± 0.1053)4株細(xì)胞之間FOXO1的表達(dá)水平有差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=85.36,P0.0001)。3 qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNAs后miR-135b的表達(dá)采用脂質(zhì)體法將miR-135b mimics和inhibitor及其對照嬖imics NC和inhibitorNC轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa 。轉(zhuǎn)染48h后,提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄后qRT-PCR檢鋇miR-135b的表達(dá)。結(jié)果顯示,miR-135b mimics使RL-952、Ishikawa中]miR-135b的表達(dá)分別提高了526.39倍(t=-20.189,P=0.002)和32.98倍(t=52.609,P=0.000)；而轉(zhuǎn)染miR-135b inhibitor后,miR-135b的表達(dá)分別降低25.28%(t=-23.539,P=0.002)和95%(t=5.966,P=0.027)。4 qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中FOXO1的mRNA的水平應(yīng)用RT-PCR檢測22對配對的子宮內(nèi)膜癌組織中FOXO1的表達(dá),以1NC為參考值,2-△△Ct通過配對樣本t檢驗(yàn)分析,結(jié)果示子宮內(nèi)膜癌組織中FOXO1的平均表達(dá)量為1.6654±1.6861,顯著大于子宮內(nèi)膜癌癌旁組織中FOXO1的平均表達(dá)量為3.2708±3.4159,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.559,P=0.018)。5 MTT比色實(shí)驗(yàn)我們采用MTT法檢測細(xì)胞生長曲線,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-135b mimic后,RL-952和Ishikawa細(xì)胞生長加快(P=0.0000,0.0000)：而轉(zhuǎn)染miR-135b inhibitor后,兩種細(xì)胞生長速度減慢(P=0.0000,0.0000)。6劃痕試驗(yàn)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952轉(zhuǎn)染48h后,細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化,遷移率=(原始間距一遷移后間距)/原始間距×100。劃痕24h后,四個(gè)組之間遷移率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,具有顯著性差異(F=24.67,P=0.0002),劃痕48h后,四個(gè)組之間遷移率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,具有顯著性差異(F=36.36,P0.0001)轉(zhuǎn)染miR-135b mimic后,RL-952在24h和48h的遷移率分別提高了1.54倍(t=-12.01,P=0.0003)和1.54倍(t=7.888,P=0.0014)；而轉(zhuǎn)染miR-135b inhibitor后,RL-952在24h和48h的遷移率分別降低了57.60%(t=4.490,P=0.0109)和44.17%(t=5.123,P=0.0069)。7 qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜癌組織和癌旁組織中FOXO1和HOXA10的mRNA的水平應(yīng)用RT-PCR檢測22對配對的子宮內(nèi)膜癌組織中FOXO1和HOXA10的表達(dá),以1NC為參考值,2-△△Ct通過配對樣本t檢驗(yàn)分析,結(jié)果示子宮內(nèi)膜癌組織中FOXO1的平均表達(dá)量為1.6654±1.6861,顯著大于子宮內(nèi)膜癌癌旁組織中FOXO1的平均表達(dá)量為3.2708±3.4159,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.559,P=0.018)。子宮內(nèi)膜癌組織中HOXA10的平均表達(dá)量為1.1473±0.9662,顯著大于子宮內(nèi)膜癌癌旁組織中HOXA10的平均表達(dá)量為1.8258±1.0156,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.039,P=0.006)。8 qRT-PCR檢測瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miRNA135b后FOXO1的mRNA的水平通過qRT-PCR檢鋇miR-135b過表達(dá)或抑制后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952和Ishikawa中FOXO1 mRNA的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn),miR-135b過表達(dá)后可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中FOXO1 mRNA的表達(dá),而抑制miR-135b后FOXO1 mRNA的表達(dá)升高。即miR-135b對FOXO1的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。9 Western blot檢測在FOXO1子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞內(nèi)變化對RL-952細(xì)胞株各組細(xì)胞提取全蛋白,具體步驟同前。Western blot檢測不同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后對FOXO1蛋白表達(dá)的影響。我們發(fā)現(xiàn),miR-135b過表達(dá)后可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株中FOXO1蛋白的表達(dá),而抑制miR-135b后FOXO1蛋白的表達(dá)升高,見圖6。即miR-135b對FOXO1的表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用。結(jié)論1.miR-135b在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著高于其對應(yīng)的癌旁組織。2.miR-135b參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病及增殖和遷移作用,其表達(dá)失調(diào)可影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的體外增殖和遷移能力,扮演著癌基因的角色。3. FOXO1在子宮內(nèi)膜癌組織中較其對應(yīng)的癌旁組織降低。4. HOXA10在子宮內(nèi)膜癌組織中較其對應(yīng)的癌旁組織降低。5.在子宮內(nèi)膜癌中,FOXO1為miR-135b的靶基因,miR-135b通過靶向FOXO1抑制其轉(zhuǎn)錄從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。
【關(guān)鍵詞】：子宮內(nèi)膜癌 發(fā)生 發(fā)展 miR-135b FOXO1 HOXA10
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-24
• 第一章 MIR-135B在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)24-35
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法25-32
• 1.2 結(jié)果32-33
• 1.3 討論33-35
• 第二章 MIR-135B在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生物學(xué)功能研究35-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法35-41
• 2.2 結(jié)果41-47
• 2.3 討論47-48
• 第三章 MIR-135B在子宮內(nèi)膜發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)分子機(jī)制研究48-62
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法48-55
• 3.2 結(jié)果55-59
• 3.3 討論59-62
• 全文小結(jié)62-65
• 結(jié)論65
• 不足和展望65-66
• 參考文獻(xiàn)66-70
• 英文縮略表70-71
• 成果71-72
• 致謝72-74

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 樂珍;miR-135b在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用和機(jī)制的初步探討[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號：641822